IVIM在預測高級別腦膠質瘤MGMT啟動子甲基化狀態的應用價值

田博聞，楊國強，秦江波，張輝*

腦膠質瘤是具有異質性的一種中樞神經系統腫瘤，其組織學和預后存在很大差異[1]，對于高級別的腦膠質瘤患者，手術切除聯合放化療是標準的治療方法，而目前最常用的化療靶向藥物就是替莫唑胺[2]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一種DNA修復酶，參與了細胞防御誘變和烷基化劑毒性修復的過程，導致腫瘤對烷基化劑產生抗藥性，而MGMT啟動子的甲基化在表觀遺傳學上使MGMT基因沉默，提高腫瘤對烷基化試劑的敏感性[3]，因此攜帶MGMT啟動子甲基化的腦膠質瘤患者在化療后總體生存期和病情進展時間均有所增加[4]，但是目前的實驗室檢測主要依賴于基因分析方法，需要通過活檢或手術切除獲得腫瘤組織，而基因檢測受到了檢測費用昂貴、檢測周期長以及腫瘤異質性的約束[5]，因此術前無創性地對MGMT啟動子甲基化狀態進行預測對于患者預后的評估以及個性化治療方案的選取有重要的臨床意義[6-7]。

擴散和灌注磁共振成像常用于腫瘤組織的定性和治療反應的評估[8]，體素內不相干運動(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像是一種從多個b值的擴散加權圖像中分離定量微血管灌注信息的方法，可以在無需對比劑的情況下更準確地反映腫瘤的微環境[9]，本研究旨在探討IVIM各參數對高級別腦膠質瘤MGMT啟動子甲基化狀態的預測價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2016年10至2019年6月在山西醫科大學第一醫院病理確診為原發性高級別腦膠質瘤的患者34例，其中MGMT啟動子甲基化組19例和MGMT啟動子非甲基化組15例。納入標準：(1)經組織病理學證實為WHO Ⅲ～Ⅳ級原發性腦膠質瘤的患者；(2)術前均行常規MRI平掃、增強掃描及IVIM序列掃描檢查；(3)使用焦磷酸測序法檢測MGMT啟動子甲基化狀態并獲得準確結果。排除標準：(1)患者在MRI采集和手術前進行放化療或其他治療；(2)圖像偽影嚴重，影響參數的測量。研究的設計和方案已獲得山西醫科大學第一醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 圖像采集

所有的MRI數據都是使用GE 3.0 T磁共振成像和頭頸關節八通道相控陣線圈掃描。IVIM掃描和增強掃描均在相同條件下進行。T1WI增強掃描參數：TR 2002.20 ms，TE 24.20 ms，層厚6.0 mm，FOV 24 cm×24 cm；IVIM-DWI的平面回波序列(echo-planar imaging，EPI)掃描參數如下：TR 6550 ms，TE 116 ms，層厚6.0 mm，NEX為3，FOV 24 cm×24 cm，矩陣128×128，層間距為1.0 mm。選取的13個b值分別為：0、20、50、100、200、400、800、1200、1800、2500、3000、3500、4000 s/mm2。

1.3 MGMT啟動子甲基化狀態的測定

使用焦磷酸測序法測定患者腫瘤細胞的MGMT啟動子甲基化狀態，使用Simlex-OUP?FFPE DNA提取試劑盒(TIB，中國)從冷凍腫瘤組織中提取DNA，然后使用NanoDrop 2000 (Thermofisher，美國)分光光度法進行定量，使用外延亞硫酸氫鈉試劑盒(Qiagen，德國)進行硫酸氫鈉改性。之后采用PCR結合熱標記Q96系統(Qiagen，德國)在10個CpG島進行熱測序MGMT啟動子內的區域。如果CpG區域的平均甲基化率≥8%，腦膠質瘤被定義為甲基化，否則腫瘤被認為是非甲基化[8]。

1.4 定量參數測量及腫瘤分割

將原始圖像傳輸到工作站(advantage workstation 4.4，GE醫療系統)，采用Functool工具包中的MADC軟件對圖像進行后處理分析。分別獲得IVIM各參數：真擴散系數(true diffusion coefficient，D)、灌注相關擴散系數(perfusion related diffusion coefficient，D*)、灌注分數(perfusion fraction，f)的偽彩圖，腫瘤組織的感興趣區域(region of interest，ROI)由2名資深的影像科醫師分別參照同層面軸位增強T1WI所示強化最大區域(避開囊變、出血等)手動勾畫，ROI大小約40～60 mm2，在最大層面及相鄰上下層面測量三次取平均值。為了避免個體差異帶來的誤差，將腫瘤實質區各參數平均值除以對側正常腦實質區平均值，計算得到校正后參數值：rD (relative D)、rD*(relative D*)、rf (relative f)。

1.5 統計學方法

分析數據使用統計軟件SPSS 22.0，結果采用平均值±標準差表示，然后測試獲得數據的正態性。在校正參數定量分析中，采用組內相關系數(intraclass correlation coefficient，ICC)來評價2名觀察者之間的一致性，當ICC值＞0.75時則表示信度良好。對于符合正態分布的數據，使用兩獨立樣本t檢驗進行分析，如果不符合正態分布，則使用秩和檢驗進行分析，檢驗rD、rD*、rf在MGMT啟動子甲基化組與非甲基化組間的差異性，對具有統計學意義(P＜0.05)的參數，進一步繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，用曲線下面積、靈敏度、特異性和相應的最佳分界閾值，評估各參數的診斷性能。

2 結果

2.1 臨床特征分析

本次研究共收集高級別腦腦膠質瘤患者34例，其中WHO Ⅲ級(19例)，Ⅳ級(15例)，MGMT啟動子甲基化率為55.9%(19/34)，Ⅲ級甲基化率57.9%(11/19)，Ⅳ級甲基化率53.3%(8/15)。性別比例:甲基化組19例(男11例，女8例)，非甲基化組15例(男8例，女7例)。平均年齡：甲基化組(48.73±12.13)歲，非甲基化組(52.68±12.69)歲，各組間年齡、性別以及MGMT啟動子甲基化在Ⅲ、Ⅳ級的分布差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 觀察者一致性分析

觀察者間測量各校正參數的一致性良好，其中rD的觀察者間ICC值為0.914 (95% CI：0.824～0.948)；rD*的觀察者間ICC值為0.921 (95% CI：0.845～0.954)；rf 的觀察者間ICC值為0.897 (95% CI：0.818～0.925)。

2.3 影像參數分析

高級別腦膠質瘤中MGMT啟動子甲基化組中rD、rf值高于非甲基化組，rD*值低于非甲基化組，差異均有統計學意義(P＜0.05)(表1)。各模型所得參數ROC曲線及診斷效能見表2和圖1、2。

表1 不同MGMT啟動子甲基化狀態的高級別腦膠質瘤IVIM參數比較Tab. 1 Comparison of IVIM parameters of high-grade gliomas with different MGMT promoter methylation status

表2 IVIM參數對MGMT啟動子甲基化狀態的診斷效能Tab. 2 Diagnostic efficacy of IVIM parameters on methylation status of MGMT promoter

3 討論

3.1 IVIM參數的原理及意義

磁共振擴散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)使用水分子作為內源性對比劑來評估腫瘤的擴散率和組織微結構，隨著磁共振(magnetic resonance，MR)設備的不斷發展及對DWI研究的深入，通過設置較大范圍內多個b值進行DWI掃描，并基于雙指數模型可以分離水分子運動相關的擴散及灌注參數，有助于更好的分析組織特征和治療監測。大量文獻報道，當b值＜200 s/mm2且大于4個時能更有效準確地反映灌注相關信息[10-11]。關于IVIM參數的生理基礎，有學者認為D、D*和f分別對應組織擴散率、毛細血管血流速度和毛細血管血流的分數體積，根據灌注分數乘以灌注相關擴散系數的乘積可以估算出灌注量[9，12]。

3.2 擴散參數的相關分析

本研究表明MGMT啟動子甲基化組較非甲基化組有更高的rD值，并且有統計學意義，這與Moon等[13]的研究結果相同，高的rD值表示甲基化組的腫瘤細胞密度低，細胞間隙大以及水分子擴散受限程度更輕。推測可能的原因是MGMT是一個人體正常存在的自我修復蛋白，可以防止細胞內基因突變，進而細胞凋亡的一種修復酶。而MGMT啟動子甲基化后，沉默了MGMT基因的啟動序列，使其處于停滯狀態無法正常轉錄翻譯，導致細胞中的MGMT蛋白合成減少，損傷和突變的基因序列不能被MGMT蛋白修復而變形失活，導致腫瘤細胞凋亡[14]。也有研究表明MGMT啟動子甲基化會增加DNA的不穩定性，使得DNA更容易發生突變和裂解，進而導致細胞的凋亡，所以MGMT啟動子甲基化的腫瘤細胞密度更小，rD值更高，提示其具有更好地預后。此外Rundle-Thiele等[15]對于膠質母細胞瘤的患者做了進一步的研究，他們使用直方圖統計法對數據進行分析，得出的結果是MGMT啟動子甲基化組的腫瘤細胞具有更低的擴散參數，水分子擴散受限程度更重，與本研究結果不同，這可能是由于方法的不同所導致，包括ROI的選擇、統計分析和不同的分組(高級別膠質瘤和膠質母細胞瘤)。

3.3 灌注參數的相關分析

MGMT啟動子甲基化組與非甲基化組相比，出現了rD*值的降低和rf值的升高。rD*與腫瘤內毛細血管的生成及血流量有關，表示MGMT啟動子甲基化組較非甲基化組有更低的灌注，與Ryoo等[16]的研究結果一致，說明在甲基化組中微循環灌注更低，毛細血管生成更少，提示腫瘤具有更弱的侵襲性。Chahal等[17]認為，MGMT參與了腫瘤的發生與進展，MGMT陽性細胞的血管內皮生長因子受體水平較高，而血管內皮生長因子與受體的結合能促進內皮細胞的增殖與存活，從而加速了腫瘤血管的生成與發育，所以當MGMT啟動子甲基化后使得MGMT基因沉默，減少了腫瘤內血管的生成，進而解釋了甲基化組的腫瘤內毛細血管的生成減少，血流量降低，rD*值降低原因。

MGMT啟動子甲基化組較非甲基化組有較高的f值，提示其具有更高的灌注占比，有研究表明，f值與動態對比增強磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)中的容積轉運常數(volume transfer constant，Ktrans)值有強相關性[18]，預示著兩者機制之間有相似之處，Ktrans值是表示微血管通透性相關參數。而AHN等研究發現，MGMT啟動子甲基化組有更高的Ktrans值，可能是由于Ktrans值增加意味著替莫唑胺更容易滲透，從而導致治療成功率的增加以及更好的預后表現[19]，所以筆者認為f值的升高可能是由于在同等灌注下，MGMT啟動子甲基化組具有更高的毛細血管通透性，導致其灌注分數升高，表示其具有更高的血藥交換率，這與也與臨床上研究的甲基化組的腫瘤對替莫唑胺有更高的敏感性一致，還有研究表明在高級別腦膠質瘤中高Ktrans值患者的生存期更長[20]，因此f值對腦膠質瘤患者生存期的預測也有重大的潛力。

然而，這項研究仍有一些局限性，主要包括以下幾點：(1)研究中心為單中心且樣本規模小不具有代表性；(2)感興趣區的劃取和腫瘤標本的切片區域不符合，導致的空間異質性帶來的誤差；(3)多b值的選取也不是最佳選擇。

綜上所述，IVIM能無創評估腦膠質瘤MGMT啟動子甲基化狀態，其中rD*的靈敏度較高，有助于指導高級別腦膠質瘤患者的個性化診治方案以及對預后的評估。

利益沖突：無。