針刺調節炎性細胞因子改善大鼠腦梗死急性期腦血流的USPIO-DSC MRI研究

楊爍慧，吳瑜，詹松華，楊辰瑤，孔營楠，張成，陸方*

中風是世界范圍內第五大常見的成人致死的病因，也是成人永久性致殘最常見的原因之一。由腦血管斑塊堵塞或血栓栓塞引起的缺血性中風約占所有中風的87%[1]。越來越多的證據表明，缺血性中風后炎性反應對于中風的進展和預后有重要影響[2]。已有研究證明針刺可以減輕缺血性中風后炎性反應[3]以及改善腦梗死區域微循環灌注[4-7]。超微超順磁氧化鐵微粒(ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxides，USPIO)是一種血池性對比劑，其血漿半衰期長，磁敏感效應強，高劑量耐受性好，較釓噴酸葡胺鹽(GDDTPA)更能準確反映梗死區域腦血流的灌注情況[8]，因此，筆者利用USPIO動態磁敏感增強(USPIO-dynamic susceptibility contrast，USPIO-DSC) MRI灌注掃描來探討針刺通過調節大鼠腦梗死急性期血清炎性細胞因子的水平以達到改善腦梗死區域血流灌注的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

本實驗通過本院倫理和動物保護委員會備案和批準(SZY201712006)。清潔級健康成年雄性SD大鼠26只，體重規格為230～250 g (購于北京維通利華實驗動物公司，在上海中醫藥大學實驗動物中心飼養)。將大鼠隨機分為三組，A組假手術組6只、B組無電針梗死組10只、C組電針梗死組10只，每組再根據時間節點24 h、48 h分為二個亞組，C組24 h和48 h亞組各有一只大鼠因造模失敗而剔除出組，最終入組A組每個亞組各3只大鼠，B組每個亞組各5只大鼠，C組每個亞組4只大鼠。

1.2 模型制作

SD大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.35 ml/100 g。大鼠永久性大腦中動脈栓塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)的建立參照Longa線栓法[9]并且加以改良，其中A組線栓插入深度距離頸總動脈分叉約0.5 cm，B組和C組線栓插入深度距離頸總動脈分叉約1.6～2.0 cm，B組和C組大鼠造模麻醉蘇醒后有相應轉圈、側倒或偏癱視為造模成功。

1.3 針刺方法

C組大鼠穴位定位按照李忠仁等[10]制定的實驗動物腧穴圖譜，選取百會穴、右側足三里穴和水溝穴，以醫用華佗牌不銹鋼28號1.5寸(1寸=3.33 cm)毫針快速刺入穴位，連接電針治療儀(G6805-2，上海醫療器械高技術公司)。刺激參數為：疏密波4 Hz/20 Hz，脈沖寬度0.5 ms[11]。輸出電壓從1 V開始，每10 min增加1 V，最大為3 V，輸出電流0.5 mA。造模完成待大鼠完全蘇醒后執行第一次針刺，其后每間隔24 h電針一次，每次電針通電30 min，每日電針一次。A組大鼠在造模后不加任何處理，B組大鼠在C組大鼠電針的同時對其進行捆綁固定，不做針刺。

1.4 儀器和方法

所有檢查均在1.5 T磁共振系統(UMR560；上海聯影醫療技術有限公司，上海，中國)上完成，采用12通道相控陣腕關節線圈。MR掃描序列及參數：冠狀位T1WI快速自旋回波序列(TR 450 ms，TE 12 ms，層厚2 mm，間距0.2 mm，FOV 80 mm×80 mm，矩陣100×192，NEX為4)、T2WI快速自旋回波序列(TR 3000 ms，TE 154 ms，層厚2 mm，間距0.2 mm，FOV 80 mm×80 mm，矩陣100×192，NEX為4)、DWI單次激發平面回波序列(TR 2500 ms，TE 94 ms，層厚3 mm，間距0.3 mm，FOV 100 mm×100 mm，矩陣100×96，NEX為5，b=0和1000 s/mm2)、T2*WI動態磁敏感加權序列(TR 1400 ms，TE 36 ms，層厚2 mm，間距0.2 mm，FOV 100 mm×100 mm，矩陣100×96，NEX為1)。T2*WI 動態磁敏感對比增強(susceptibilityweighted contrast-enhanced，DSC) MRI共掃描60個動態，前5個動態作為基線掃描，第6個動態開始，從大鼠尾靜脈以0.1 mL/s團注6 mg Fe/kg[12]USPIO溶液(上海交通大學Med-X研究所提供)。

1.5 圖像評價

所有模型鼠DSC MRI原始圖像傳至聯影后處理工作站，原始圖像經過運動偽影校正，去除背景噪聲，動脈輸入函數(arterial input function，AIF)選取等獲得相對腦血流量(relative cerebral blood flow，rCBF)圖，相對腦血容量(relative cerebral blood volume，rCBV)圖。在A、B、C組每個大鼠各參數比值的測量過程中，先由2名具有10年以上神經MRI診斷經驗的放射科醫師翻閱DSC原始圖像后共同協商出一個測量層面，再分別獨立于B、C二組大鼠的該DSC原始圖像上沿梗死區邊緣勾畫ROI，測量并記錄rCBV，rCBF各參數值，再于對側正常鏡像區域畫取同樣大小的ROI并測量各參數值(圖1)。A組在相同解剖部位于協商獲得的層面上測量左右兩側各參數值。將測得的各參數值以梗死側/正常側(A組，右側/左側)得出各參數比值(rrCBV、rrCBF)后做進一步統計分析。每人分別進行2次測算獲得數據，每次測量間隔一周，然后取平均值用于后續影像學檢查。

1.6 病理檢查

各亞組大鼠磁共振掃描結束后，打開腹腔，暴露腹主動脈，使用10 ml注射器進行取血，將全血放入離心管中，室溫靜置2 h后開始離心，離心機的設置為3000轉/min，10 min，4℃，使用移液槍吸取上層血清，放入凍存管內，-80℃冰箱內保存，待實驗結束后統一使用血清炎性細胞因子ELISA試劑盒檢測，血清炎性細胞因子檢測指標分別為IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 pMCAO大鼠USPIO-DSC各參數比值(rrCBV，rrCBF)

A組、B組和C組24 h和48 h各參數比值(rrCBV，rrCBF)見表1。24 h和48 h A、B、C 3組的rrCBV (24 h：χ2=9.035，P=0.011；48 h：χ2=8.909，P=0.012)和rrCBF (24 h：χ2=9.692，P=0.008；48 h：χ2=5.333，P=0.021)均顯著不同。A組與B組比較，A組24 h亞組的rrCBV (Z=-2.236，P=0.025；)、rrCBF (Z=-2.236，P=0.025)均顯著高于B組；48 h亞組的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)、rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)亦均顯著高于B組。A組與C組比較，A組24 h亞組的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)和rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)均顯著高于C組。48 h亞組的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)、rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)亦均顯著高C組。B組和C組比較，C組24 h亞組 rrCBV (Z=-2.205，P=0.027)和rrCBF (Z=-2.449，P=0.014) 顯著高于B組；48 h亞組rrCBV和rrCBF均顯著高于B組(Z=-2.309，P=0.021)(圖1)。

2.2 pMCAO大鼠24 h和48 h血清炎性細胞因子分析

表1 T2*WI DSC序列pMCA_O大鼠rrCBV和rrCBF的平均值(±s)Tab. 1 Values of rrCBV and rrCBF mea_sured on T2*WI DSC images of pMCAO rats (±s)

表1 T2*WI DSC序列pMCA_O大鼠rrCBV和rrCBF的平均值(±s)Tab. 1 Values of rrCBV and rrCBF mea_sured on T2*WI DSC images of pMCAO rats (±s)

組別24 h48 h rrCBV A組0.98±0.040.99±0.03 B組0.42±0.090.40±0.04 C組0.63±0.130.74±0.17 rrCBF A組0.97±0.050.98±0.04 B組0.32±0.080.27±0.05 C組0.48±0.060.46±0.11

表2 pMCAO大鼠24 h及48 h血_清炎性細胞因子均值±標準差(±s)Tab. 2 Values of serum inflammatory cytok_ines detected on 24 h and 48 h of pMCAO rats (±s)

表2 pMCAO大鼠24 h及48 h血_清炎性細胞因子均值±標準差(±s)Tab. 2 Values of serum inflammatory cytok_ines detected on 24 h and 48 h of pMCAO rats (±s)

組別IL-1βIL-6IL-10TNF-α 24 h A組9.415±0.954 8.257±0.885 18.439±0.870 15.784±0.709 B組27.800±2.463 15.180±5.547 20.400±1.660 20.440±1.662 C組22.040±1.645 9.682±0.818 33.300±5.450 20.400±1.520 48 h A組 11.679±1.005 11.537±0.921 16.048±0.472 13.981±2.194 B組14.860±3.101 20.960±6.354 16.370±3.300 18.830±5.152 C組12.020±0.643 13.890±3.336 22.980±4.606 13.710±1.100

表3 B組+C組大鼠24 h rrCBV、rrCBF與各炎性細胞因子相關性Tab. 3 Correlations between values of rrCBV，rrCBF and inflammatory cytokines on 24 h of B plus C groups of rats

表4 B組+C組大鼠48 h rrCBV、rrCBF與各炎性細胞因子相關性Tab. 4 Correlations between values of rrCBV，rrCBF and inflammatory cytokines on 48 h of B plus C groups of rats

表5 pMCAO大鼠24 h和48 h rrCBV、rrCBF觀察者間一致性檢驗Tab. 5 The inter-observer agreement test of rrCBV、rrCBF on 24 h and 48 h of pMCAO rats

A組、B組和C組大鼠24 h和48 h血清炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α數值見表2。A組與B組比較，A組24 h亞組的IL-1β (Z=-2.236，P=0.025)、IL-6 (Z=-2.236，P=0.025)、TNF-α (Z=-2.249，P=0.024)均顯著低于B組，IL-10 (Z=-1.65，P=0.099)差異無統計學意義。A組48 h亞組的IL-1β (Z=-2.141，P=0.032)、IL-6 (Z=-2.121，P=0.034)均顯著低于B組。IL-10 (Z=-0.354，P=0.724)、TNF-α (Z=-1.768，P=0.077)差異無統計學意義。A組與C組比較，A組24 h亞組的IL-1β (Z=-2.121，P=0.034)、IL-10 (Z=-2.141，P=0.032)、TNF-α (Z=-2.121，P=0.034)均顯著低于C組，IL-6 (Z=-1.62，P=0.105)差異無統計學意義。48 h亞組的IL-1β (Z=-0.354，P=0.724)、IL-6 (Z=-0.707，P=0.480)、IL-10 (Z=-1.768，P=0.077)、TNF-α (Z=0.000，P=1.000)差異無統計學意義。B組和C組比較，24 h亞組C組IL-1β (Z=-2.205，P=0.027)、IL-6 (Z=-1.968，P=0.049)顯著低于B組，IL-10 (Z=-2.470，P=0.014)顯著高于B 組。C組TNF-α略低于B 組(P=0.803)。48 h亞組IL-1β (Z=-2.323，P=0.02)、IL-6 (Z=-2.021，P=0.043)、TNF-α (Z=-2.309，P=0.021)顯著低于B組，IL-10 (Z=-2.021，P=0.043)顯著高于B組。

2.3 pMCAO大鼠USPIO-DSC rrCBV、rrCBF與炎性細胞因子相關性分析

B組+C組24 h和48 h各參數比值(rrCBV、rrCBF)與炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α相關性見表3、4。B組+C組24 h亞組rrCBV、rrCBF與IL-1β、IL-6呈顯著負相關，與IL-10呈顯著正相關，rrCBV與TNF-α呈顯著正相關，對相關系數進行統計分析，差異有統計學意義(P＜0.05)。B組+C組48 h亞組rrCBV、rrCBF與IL-1β呈顯著負相關，rrCBV與IL-10呈顯著正相關，對相關系數進行統計分析，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 pMCAO大鼠USPIO-DSC rrCBV、rrCBF觀察者間一致性檢驗

pMCAO大鼠24 h和48 h rrCBV、rrCBF觀察者間一致性檢驗見表5。

3 討論

腦梗死發生后，死亡的神經元等腦細胞釋放損傷相關模式分子蛋白(damage associated molecular pattern molecules，DAMPs)，激活腦內作為主要免疫效應細胞的小膠質細胞，誘導炎性反應級聯。活化的小膠質細胞分為2大類，一類是促炎型(M1型)，釋放促炎的細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，一類是抗炎型(M2型)，釋放抗炎的細胞因子IL-4、IL-10等。腦梗死后炎性反應在腦梗死的演化過程中具有雙重作用，一方面損害血腦屏障，破壞血管結構，趨化白細胞浸潤，造成神經血管單元的破壞和腦水腫。另一方面募集巨噬細胞吞噬梗死區死亡細胞、血管碎片等，誘導內皮細胞增殖，促進血管生成和神經血管單元重塑，改善神經功能預后。炎性反應是一把雙刃劍，腦梗死后適度的炎性反應是有利的，過度的炎性反應不利于腦組織修復，因此調控腦梗死后炎性反應成為近些年來研究的靶點之一[13]。大量實驗研究證實[14-15]，下調促炎細胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α的水平和上調抗炎細胞因子IL-10等的水平可以減輕tMCAO大鼠腦梗死的體積和改善神經功能預后。針刺作為腦梗死治療的重要手段，其減輕腦梗死后炎性反應已在眾多實驗研究中得到證實[16-19]。Geng等[16]研究發現針刺水溝、內關穴能減輕腦缺血再灌注(I/R)大鼠急性期腦梗死體積，并通過上調腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達經由DOR-BDNF/TrkB信號通路抑制促炎細胞因子IL-1β的表達和促進抗炎細胞因子IL-10的表達來抑制腦梗死后急性期炎性反應。王金海等[19]也提出上調IL-10的表達，抑制IL-1β、IL-6等促炎細胞因子的過度表達，可能是頭穴針刺調節缺血性腦血管病炎性反應的機制之一。本研究結果顯示大鼠腦梗死后24 h和48 h，針刺可以顯著降低大鼠血清中的促炎細胞因子IL-1β、IL-6水平及升高大鼠血清中的抗炎細胞因子IL-10水平，另外可以降低48 h大鼠血清中的TNF-α水平，與上述實驗研究結果基本相符。

腦梗死后阻塞血管的再通以盡早恢復責任血管供應范圍內的血流對挽救缺血腦組織和改善神經功能預后至關重要，目前溶栓或血管內機械取栓是急性腦梗死治療最有效的策略之一，但由于其較窄的治療時間窗及出血等并發癥，只有約5%的患者能從中獲益，絕大多數患者急性腦梗死后梗死區及周圍血流的恢復依賴于側支循環的逆行血流，因此改善梗死區域側支循環是近些年來研究的另一重要靶點[20]。研究表明應用血液稀釋劑降低血液黏度、誘導高血壓、上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平和內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移植等能夠增加側支循環的早期動脈生成和晚期血管生成，增加側支循環的腦血容量和腦血流量[20]。研究證實，針刺可以改善梗死區域的側支循環[6-7，21]。Shi等[21]研究發現電針水溝穴能夠明顯增加腦缺血再灌注(I/R)大鼠腦梗死急性期梗死區及周圍腦組織的腦血流量，并通過促進梗死區及周圍微血管內皮細胞的增生來促進血管生成，從而改善局部的側支循環。本研究得到了相似的結果，C組24 h和48 h大鼠梗死區的rrCBV和rrCBF均顯著高于B組，說明針刺能夠改善梗死區的側支循環。進一步研究發現腦梗死后急性期B組+C組24 h亞組rrCBV、rrCBF與血清IL-1β、IL-6水平呈顯著負相關，與血清IL-10水平呈顯著正相關，48 h亞組rrCBV、rrCBF與血清IL-1β呈顯著負相關，rrCBV與血清IL-10呈顯著正相關。筆者分析認為針刺在減輕腦梗死后炎性反應與改善側支循環表現出協同作用，其可能的機制與針刺調節腦梗死區活化的小膠質細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞的功能有關[21-23]，針刺促進活化的M1型小膠質細胞向M2型轉化，發揮抗炎作用，減輕血腦屏障的破壞，進一步調節鄰近星型膠質細胞功能促進受損及新生血管血腦屏障的完善，另外針刺可以減輕血管平滑肌痙攣及促進內皮細胞的增殖，從而促進腦梗死后側支循環的動脈生成和血管生成進而增加梗死區域的腦血流量和腦血容量。本研究結果顯示B組與C組24 h亞組的TNF-α水平未見明顯差異，針刺對TNF-α調節作用始于缺血后48 h。TNF-α是具有雙重作用的細胞因子[24]，兼具有神經毒性和神經保護作用。TNF-α在腦梗死急性期具有擴血管及維持梗死區腦血容量的作用[25]。本研究結果提示腦梗死急性期較早的時候針刺具有選擇性調節TNF-α的可能性，但需進一步實驗研究探明。

本實驗研究有一定的局限性。首先，本次實驗造模大鼠數量較少，觀察的時間點設置較少，無法充分反映針刺對腦梗死后急性期血清炎性細胞因子及腦梗死區側支循環狀態的影響。其次，我們沒有對腦梗死區腦實質內的炎性細胞因子進行檢測，因而無法闡述針刺對腦梗死區腦實質內的炎性細胞因子的直接影響。第三，針刺減輕腦梗死后炎性反應與改善梗死區側支循環血供的協同機制有待進一步深入研究，后續實驗研究正在進行中。

總之，本實驗研究初步證實針刺通過調控大鼠腦梗死急性期血清炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平來減輕腦梗死后炎性反應，進而改善腦梗死區側支循環血供。

利益沖突：無。