急性缺血腦卒中患者血清miR-9的表達及其與炎癥的相關性①

張玉敏 韓素桂 劉啟為 周 琪 盧軍利

(唐山市人民醫院臨床檢驗科，唐山 063000)

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是指由各種原因導致的腦組織血液供應障礙，并由此產生缺血缺氧性壞死，進而引起神經功能障礙的一系列臨床綜合征，也稱為急性腦梗死，是最為常見的卒中類型，約占全部卒中的60%～80%[1]。在全球范圍內，腦血管病占據致死疾病第二位，而在中國腦血管疾病致死中居于首位，我國腦卒中年發病率約為120～180/10萬人，年死亡率高達60～120/10萬人，未死亡的腦卒中患者約75%以上出現不同程度的殘疾[2,3]。因此，研究腦卒中的病理過程對腦卒中患者意義重大。

microRNA (miRNA)是一段長度約為20 bp的非編碼RNA，通過與下游編碼或非編碼基因的3′UTR區域結合調控其表達，進而調控相應蛋白表達水平，參與調控細胞的增殖、分化、凋亡及遷移等生物學進程[4,5]。目前研究已經證實，miRNA在人體各個組織器官廣泛表達，結構穩定，其不僅是疾病診斷的優質分子標志物，還參與多種疾病的病理過程[4,5]。近年來，隨著生物芯片技術不斷發展，多種miRNA在腦組織中被發現，并被證實參與多個中樞神經系統疾病進展。Wang等[6]研究發現，miR-223在AIS患者血液和腦脊液中表達升高，并且其表達水平與腦卒中患者腦梗死體積和NIHSS評分有關，提示miR-223與AIS發病相關；Chen等[7]研究發現，中風后小鼠miR-126表達水平與心臟炎癥、心肌細胞肥大、心臟功能等有關。

miR-9是一種新發現的miRNA，在老年癡呆患者血液中低表達，并參與調控神經干細胞分化[8，9]。多個研究發現，miR-9參與腦血管疾病發生，Qiu等[10]發現miR-9表達具有腦特異性，且在AIS患者血清外泌體高表達。然而，miR-9在AIS患者血清中的表達目前未見報道。研究miR-9在AIS患者血清中表達水平及其臨床意義對提高AIS患者確診率、明確疾病進展階段及揭示AIS發病機制具有重要意義。因此，本文收集51例AIS患者血清和23例健康志愿者血清研究miR-9在AIS患者血清表達水平，探討miR-9表達與AIS患者血清炎癥的關系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 隨機選取2017年6月～2019年6月在唐山市人民醫院接受治療的AIS患者51例(AIS組)和同期于我院體檢的健康志愿者23例(HC組)為研究對象。51例AIS患者經核磁共振或者計算機斷層掃描確診，并在腦缺血24 h內經兩位副主任以上醫師對其進行NIHSS評分。兩組患者年齡、性別、合并癥及體質指數等臨床資料比較差異不顯著。納入標準：①年齡18～65周歲；②AIS患者根據《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[1]確診；③AIS患者在出現缺血癥狀12 h內且未治療前取血；④健康志愿者經體檢確認身體健康。排除標準：①AIS患者發病時間不詳，或者未能在腦缺血24 h內進行NIHSS評分；②AIS患者經治療后死亡；③合并惡性腫瘤、腦血管疾病、肝腎功能障礙或凝血功能障礙的患者；④有HIV、HBV、HCV及結核等病毒或真菌感染史的患者。本次研究經我院倫理委員會批準，所有參與患者或其家屬知情同意。

1.1.2試劑 miRNeasy RNA isolation試劑盒(Qiagen，美國)；RNAiso Plus、PrimeScri RT reagent kit with gDNA Eraser (TAKARA,寶日醫生物技術有限公司)；GoTaq Green Master Mix(Promega，美國)；IL-6 、IL-8 (H-EL-IL-8,ZYscience,美國)；TNF-α (50R-E.1693H,BIOVALUE,美國)；IL-1β (50R-E.1095H,BIOVALUE,美國) ；THP-1 (美國模式培養物集存庫,美國)；胎牛血清、1640培養基(Hyclone，美國)；miR-9-NC(5′-UCTTTTCAAGCGTTCAGTCCC-3′)，miR-9-mimic(5′-UCUUUGGUUAUCUAGCUG-UAUGA-3′)和miR-9-inhibitor(5′-AGAAACCAAUG-CGACAUACU-3′)由生工生物工程技術服務有限公司合成，并直接轉染；LipofectamineTM2000轉染試劑(Thermo Fisher Scientific，美國)；TransDetect雙熒光素酶報告分析試劑盒(全式金，中國)。S1000 PCR儀 (伯樂，中國)；ABI7500熒光定量PCR儀(ABI,美國)；5810R離心機(eppendof，美國)；DNM-9602酶標儀(北京普朗新技術有限公司,中國)。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR RNA試劑盒提取血清和細胞中總RNA。反轉錄反轉錄cDNA，反轉錄溫度設定：37℃ 1 min，85℃ 5 s，4℃保存備用。將獲得的cDNA稀釋50倍，根據GoTaq Green Master Mix說明書配制20 μl熒光定量PCR反應體系：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環40次。2-ΔΔCt法計算miR-9的相對表達水平。miR-9-F:5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3′;miR-9-R:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6-F:5′-CTCGCTTCGGCAG-CACA-3′;U6-R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2ELISA法檢測血清炎癥因子 分別用試劑盒檢測血清IL-8、TNF-α、IL-6和IL-1β含量，具體步驟參照說明書。

1.2.3外周血單個核細胞分離 離心棄外周血血清，按血液：培養基體積=1∶2向血細胞中加入1640培養基，緩慢加入體積為培養基和血細胞體積一半的人外周血淋巴細胞分離液，室溫2 200 r/min離心30 min后，取中間白色懸浮層，加入3倍體積的PBS緩沖液洗滌3遍，離心收集沉淀，即為人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

1.2.4細胞培養、轉染與雙熒光素酶檢測 THP-1和分離的PBMC均培養于含10%胎牛血清的1640培養基中，培養條件為5%CO2、37℃。10 nmol/L的miR-9-NC、miR-9-mimic和miR-9-inhibitor經LipofectamineTM2000轉染試劑轉入細胞，并在轉染后48 h 開始對SIRT1的野生型(WT)或突變型(MUT)mRNA 3′-UTR進行實驗。將基因插入 pisCHECK2載體，經LipofectamineTM2000直接轉入細胞。 并使用TransDetect雙熒光素酶報告分析試劑盒進行雙熒光素酶基因報告實驗，具體步驟參照試劑盒說明書。Westren blot檢測THP-1和健康志愿者PMBC中SIRT1表達水平。

1.3統計學分析 采用SPSS20.0軟件分析本次研究數據。Pearson法分析兩組數據間的相關性，兩組間數據差異行t檢驗，單因素方差分析用于比較3組數據間差異(Ducan法事后檢驗)。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1miR-9在AIS患者血清中表達 如圖1A所示，miR-9在51例AIS患者血清中表達水平是健康志愿者的(3.25 ± 1.02)倍。且51例AIS患者血清miR-9的相對表達水平與其NIHSS評分及患者腦梗死體積呈正相關(r=0.674,P<0.001)和(r=0.544,P<0.001) (圖1B、C)。

2.2miR-9在AIS患者血清中表達與血清炎癥因子相關性 51例AIS患者血清miR-9的相對表達水平與血清IL-6 (r=0.558,P<0.001)、IL-8 (r=0.581,P<0.001)、TNF-α (r=0.626,P<0.001) 及IL-1β (r=0.668,P<0.001) 水平均呈正相關(圖2)。

2.3miR-9抑制PBMC中SIRT1表達 THP-1細胞是從人外周血分離的單核細胞系，常用于研究外周血炎癥與免疫。通過Targetscan(http://www.targetscan.org)等生物信息學網站分析顯示， SIRT1與miR-9具有互補序列(圖3A)。如圖3B所示，轉入miR-9-mimic后，THP-1細胞miR-9表達水平顯著升高(P<0.001)；在轉入miR-9-inhibitor后，miR-9表達水平顯著降低(P<0.001)。雙熒光素酶基因報告系統顯示，miR-9-mimic可顯著降低野生型SIRT1熒光素酶活性(P<0.001)，而不能改變突變型SIRT1熒光素酶活性(圖3C)。Western blot結果顯示，miR-9-mimic可顯著降低THP-1細胞和健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達水平(P<0.001)；miR-9-inhibitor可顯著升高THP-1細胞和健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達水平(P<0.001)。

圖1 miR-9在血清中表達及其與AIS患者NIHSS評分、腦梗死體積的關系Fig.1 Expression of miR-9 in serum and its relationship with NIHSS score and cerebral infarction volume in patients with AIS

圖2 AIS患者血清miR-9與IL-6、IL-8、TNF-α及IL-1β的相關性Fig.2 Correlation between serum miR-9 with IL-6,IL-8,TNF-α and IL-1β in patients with AIS

圖3 miR-9靶向抑制PBMC中SIRT1的表達Fig.3 miR-9 targeting inhibits expression of SIRT1 in PBMCNote:A.WT SIRT1 and MUT SIRT1 fluorescein gene reporter vector sequences;B.Expression level of miR-9 was detected by RT-qPCR;C.Comparison of luciferase activity after treating THP-1 cells in different ways;D,F.Expression of SIRT1 detected by Western blot.Compared with miR-9-NC group,***.P<0.001.

3 討論

AIS是由于腦動脈閉塞導致的腦組織梗死，伴隨神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞損傷，是致死和致殘最重要的中樞神經系統血管事件。本研究發現，miR-9在AIS患者血清中表達水平顯著高于健康志愿者，且miR-9在血清中表達水平與AIS患者NIHSS評分和腦梗死體積有關。既往研究指出，miR-9在中樞神經系統疾病中發揮重要作用。Delavar等[11]在MTPP誘導的PC12細胞的帕金森細胞模型中發現，miR-9的表達顯著改變，且其參與PC12細胞的分化調控；Gu等[12]發現，miR-9通過靶向抑制HDAC5表達而過激活MEF2C-GPM6A途徑，促進神經突發育。結合本研究結果，提示miR-9可能參與AIS的發生發展。

大腦雖然只占人體重量的2%，但其耗氧量卻占人體全部耗氧量的20%，且大腦存儲能量能力極差，造成大腦對缺氧性損傷的耐受差，因缺血而導致氧氣供應不足會造成嚴重的腦組織損傷[13]。中樞神經系統因缺血而失控的炎癥反應是引起腦缺血繼發性損傷的主要原因之一。腦缺血會導致各種炎癥細胞因子表達升高從而導致神經元損傷或者凋亡，破壞血腦屏障，血腦屏障的破壞會進一步加重炎癥，導致更多的神經元和腦細胞損傷或死亡，形成惡性循環[14]。炎癥介質可刺激細胞黏附因子升高，造成中性粒細胞和單核細胞滲出，引發缺血性組織炎癥[14]。總之，炎癥在AIS腦組織損傷中發揮重要作用，抑制炎癥是治療AIS患者的重要方案之一[15-17]。本研究發現，miR-9在51例AIS患者血清表達水平及血清IL-8、TNF-α、IL-6和IL-1β含量呈正相關。既往研究證實，細胞因子是介導腦缺血后神經毒性的主要參與者，主要的神經毒性作用包括IL-1β，TNF-α介導的神經水腫，促進神經膠質增生，神經元中Ca2+增加，釋放白細胞[18]。總而言之，腦缺血后異常增加的炎癥是神經元損傷的主要原因之一。本研究提示，miR-9可能通過介導炎癥反應參與AIS疾病發展。

miR-9作為一種miRNA并不編碼蛋白質，只能通過調控其靶基因間接參與細胞調控。為進一步研究miR-9對AIS患者炎癥的調控作用，本研究通過生物學信息手段查詢到SIRT1是miR-9的靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因系統驗證miR-9靶向抑制THP-1細胞的SIRT1表達；同時miR-9-mimic可顯著抑制健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達，而miR-9-inhibitor可增加健康志愿者PBMC中SIRT1蛋白表達。提示在AIS患者血清中高表達的miR-9可能靶向抑制PBMC中SIRT1蛋白表達。

SIRT1是sirtuin蛋白家族成員，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙酰化酶，其不僅可以通過去乙酰化組蛋白維持染色質和基因組穩定，還可通過其去乙酰化非組蛋白功能參與細胞生物學功能調控[19]。既往研究指出，上調SIRT1不僅可以降低膿毒血癥小鼠體內炎癥性損傷，還可通過其去乙酰化功能而抑制p65蛋白進入細胞核而抑制NF-κB信號通路激活進而減輕炎癥，表明SIRT1在細胞中發揮炎癥抑制基因的功能，而miR-9可能通過抑制SIRT1表達而上調炎癥[20-22]。

綜上所述，miR-9在AIS患者血清高表達，且高表達的miR-9與AIS患者病情及血清炎癥呈正相關，這可能與miR-9抑制PBMC中SIRT1表達有關。