酚磺乙胺對酶法檢測血清肌酐的影響

井沆 牛志杰 劉子硯

[摘要]目的 探討酚磺乙胺對酶法檢測血清肌酐（CREA）的影響。方法 收集2019年10月于貴州省人民醫院就診患者的新鮮血清，配置成高、低濃度CREA混合血清各一份，參照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）制定的EP7-A2文件，對酶法檢測血清CREA進行干擾篩選實驗和劑量效應實驗，通過酚磺乙胺對不同濃度CREA檢測的干擾效應來探索酚磺乙胺對酶法檢測CREA的影響。結果 干擾篩選實驗：實驗組樣本均值為166.28 μmol/L，對照組樣本均值為403.44 μmol/L，實驗組的干擾值（dabs）95%CI為（-237.16±1.82）μmol/L，dabs 95%CI最低下線值 >預設干擾實驗的可接受標準（dmax）。劑量效應實驗：酚磺乙胺對低值CREA樣本的干擾效應回歸曲線方程為：Y=-1.727e-6X3+0.0016X2-0.474X-5.285（F=406.080，R2=0.981，P=0.000），當酚磺乙胺濃度在1.174 mg/L以下時，dabs<干擾實驗的dmax;而酚磺乙胺對高值CREA樣本的回歸方程為：Y=-5.105e-6X3+0.00499X2-1.632X-11.252（F=1483.642，R2=0.995，P=0.000），當酚磺乙胺濃度在9.727 mg/L以下時，dabs<干擾實驗的dmax。結論 酚磺乙胺對酶法檢測血清CREA存在負干擾，可能是檢測原理的因素導致了結果上的差異。建議咨詢患者是否服用酚磺乙胺藥物，停藥后重新抽血檢測或者有條件時可選用其他原理的CREA測定法復核，同時本研究也為CREA的準確分析提供了一定參考。

[關鍵詞]酚磺乙胺;酶法;血清肌酐;藥物干擾

[中圖分類號] R446.112 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2020）8（c）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Ethamsylate on the enzymatic detection of serum creatinine （CREA）. Methods Fresh serum was collected from patients who came to Guizhou Provincial People′s Hospital in October 2019 and prepared the collected serum to be high and low concentrations of CREA mixed serum. The interference screening experiments and dose-effect experiments were conducted on enzymatic detection of serum CREA according to the EP7-A2 document developed by the Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）. Then the interfering results at different concentrations were used to determine the effect of Ethamsylate on detection of CREA. Results Interference screening experiment： the average value of the experimental group sample was 166.28 μmol/L， and that of the control group was 403.44 μmol/L. The interference value （dabs） 95%CI of the experimental group was （-237.16±1.82） μmol/L， indicated the lowest offline value of the dabs 95%CI was greater than the acceptable standard （dmax） of the preset interference experiment. Dose-effect experiment： the regression curve equation of interference effect of enzymatic on low value CREA samples was Y=-1.727e-6X3+0.0016X2-0.474X-5.285 （F=406.080， R2=0.981， P=0.000）， when the concentration of ethamsylate was below 1.174 mg/L， the dabs was lower than the dmax for interference experiment. Meanwhile， the regression curve equation of Ethamsylate for high value CREA samples was Y=-5.105e-6X3+0.00499X2-1.632X-11.252 （F=1483.642， R2=0.995，P=0.000）， and the dabs was lower than the dmax when the concentration of Ethamsylate was below 9.727 mg/L. Conclusion Ethamsylate causes the negative interference on the serum CREA detection by enzymatic method which may be attribute to the factors of detection principle. It is suggest to consult the patients whether to take Ethamsylate drug， redraw blood after discontinuation of the drug， or use other principles of CREA assay to check if necessary. Meanwhile， this study also provides some references for the accurate analysis of CREA.

[Key words] Ethamsylate; Enzymatic method; Serum creatinine; Drug interference

肌酐（creatinine，CREA）作為高能量化合物磷酸肌酸的分解物，由肌肉組織及神經組織釋放至血液中，血液中的CREA經腎小球濾過后大部分不被再吸收，而是直接由尿排出體外。血清中的CREA濃度會因腎功能不全、尿毒癥而上升，CREA作為腎功能的監測指標在腎臟疾病的診斷及治療過程中具有重要意義[1]。

酚磺乙胺又名止血敏，主要用于血小板功能不全引起的出血、胃腸道出血、腦出血及泌尿道出血等多種出血的預防和治療[2]。已有文獻資料報道稱[3-4]，使用酚磺乙胺的患者在通過酶法檢測血清CREA所得出的結果會大幅度波動，與患者的臨床表現有較大差異，導致醫生與患者對檢驗結果的準確性提出質疑，且不準確的結果還會造成對患者病情的誤判，從而耽誤治療。通常醫生和患者會誤以為是酚磺乙胺的藥理作用，也有可能是酚磺乙胺對酶法檢測CREA存在藥物干擾所導致。酚磺乙胺在臨床中應用非常廣泛，因此它的干擾效應應該充分被臨床醫生和檢驗人員認識和關注。

目前關于酚磺乙胺對酶法檢測血清CREA干擾的具體研究報道少見，且其干擾原理一直有待闡明。本研究參照美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP7-A2文件[5]和文獻生物變異[6]推薦的干擾實驗方法，通過體外干擾實驗，探討酚磺乙胺對酶法檢測CREA的干擾效應，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2019年10月于貴州省人民醫院就診患者的新鮮血清，配置成高、低濃度CREA混合血清各一份。納入標準：①近期未用藥治療的體檢者標本;②標本無黃疸、無溶血;③按EP7-A2的要求，各分析物的測試濃度是醫學決定水平的高值或異常值。

1.2儀器

美國雅培C16000全自動生化分析儀。

1.3試劑

①酚磺乙胺注射液（國藥集團容生制藥有限公司，國藥準字H20057257），其主要成分為酚磺乙胺，規格：0.5 g/2 ml，根據《中華人民共和國藥典》[7]及其藥代動力學特性，本實驗采用0.3 g/L酚磺乙胺的最高血藥濃度。②酶法CREA試劑及配套校準品（日本積水公司，批號：840RCQ）。

實驗前對檢測儀器進行精密度評估，采用試劑原裝標準品對CREA進行校準并進行定期質控，觀察檢測方法的穩定性[8]，室內質控品由美國伯樂公司（BIO-RAD）生產的多項目臨床化學定值質控血清，兩個水平，批號為26421、26422。

1.4方法

1.4.1干擾篩選實驗 ?①取酚磺乙胺注射液一瓶（濃度為250 g/L）與生理鹽水按照1∶50比例配置成酚磺乙胺濃度為5 g/L的實驗樣本（原液），將原液與CREA濃度440 μmol/L左右的混合血清按照1∶9的比例配置成酚磺乙胺濃度為500 mg/L的溶液，同時用生理鹽水和CREA血清按同比例混合為對照樣本，分析酚磺乙胺對酶法檢測CREA是否存在干擾。②按交互順序分析測試實驗樣本和對照標本并記錄結果。

1.4.2干擾劑量效應實驗 ?預稀釋：取一支酚磺乙胺溶液，配置成藥物濃度為5000.00、3000.00、1500.00、750.00、375.00、187.50、93.80、46.90、23.50及0.00 mg/L的溶液，將高、低兩種不同濃度的CREA混合血清與上述方法配置的不同濃度酚磺乙胺的溶液按照9∶1的比例配置成干擾物濃度為500.00、300.00、150.00、75.00、37.50、18.75、9.38、4.69、2.35 mg/L及0.00 mg/L的藥物干擾劑量效應測試樣本（實驗組）。對照組將酚磺乙胺注射液換成等體積生理鹽水，其他步驟同上。

1.4.3干擾實驗的測量 ?根據生物學變異質量規范中允許總誤差（Tea%）和臨床專家的意見以CREA偏差6.9%作為干擾實驗的可接受標準（dmax），實驗室CREA批內標準差（s）由基礎實驗樣本重復測定10次計算得出，計算出最大允許干擾值（dmax）與批內標準差（s）的比值dmax/s，采用95%置信區間（95%CI），查EP7-A2文件附表得出干擾篩選實驗的重復測量次數為3次。干擾劑量效應實驗，2個不同系列的實驗樣本和對照樣本分別檢測血清CREA，每個標本重復檢測3次[9]。

1.4.4干擾效應分析 ?干擾篩選實驗：計算干擾值（dabs）和dabs 95%CI，dabs為干擾實驗樣本的均值減去對照樣本均值的差值，dabs 95%CI=dabs±t0.975（n-1）×（2s2/n）1/2，干擾的判斷標準為dabs 95%CI最低值>dmax時認為存在藥物干擾[10]。干擾劑量效應實驗：將不同濃度的干擾物實驗樣本檢測的均值減去對照樣本均值得到單獨的dabs值，用SPSS 22.0軟件制作X軸（不同干擾物濃度）和Y軸（單獨的dabs）的散點圖，繪制干擾劑量實驗的效應圖。

1.5統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示。對劑量效應實驗中不同方法的干擾效應與酚磺乙胺注射液濃度進行非線性回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1干擾篩選實驗結果

根據干擾實驗的測量，CREA累積批內標準差（s）：1.39，CREA偏差6.9%即dmax=403.44 μmol/L×6.9%=27.84 μmol/L，dmax/s>3，根據EP7-A2文件附表得出單個標本重復檢測次數為3次，含酚磺乙胺濃度（50 mg/L）實驗組均值：166.28 μmol/L，對照組均值：403.44 μmol/L，dabs=實驗組均值-對照組均值= -237.16 μmol/L，dabs 95%CI=（-237.16±1.82）μmol/L，∣dabs 95%CI∣>dmax。

2.2干擾劑量效應實驗結果

酚磺乙胺濃度0.00～500.00 mg/L范圍內所對應高低CREA樣本的dabs值見表1，劑量效應回歸曲線分析圖見圖1～2。低值CREA（68.50 μmol/L）樣本，用計算機得出干擾劑量效應回歸方程顯著性檢驗F=406.080，R2=0.981，P=0.000，酚磺乙胺濃度在1.174 mg/L以下時dabs

3討論

CREA是磷酸肌酸的代謝終產物，由腎小球排出，是臨床評價腎功能最簡單、最廣泛的腎功能血清指標，血清CREA濃度受肌肉質量、腎小管分泌物和炎癥等多種因素的影響[11-12]。本研究結果提示，系統偏差、不精密度和干擾是導致患者檢測值與真實值之間差距的主要原因。我國臨床實驗室檢測CREA的方法主要有兩大類：苦味酸法和酶法[13-15]。苦味酸法反應為非特異性反應，由于不穩定因素較多，準確性相對較差，苦味酸法現已被酶法取代。在本實驗中，選擇的是日本積水酶法CREA試劑，其檢測原理包括如下。反應一：標本中的CREA在肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、過氧化氫酶的作用下被分解成水和氧;反應二：標本中的CREA在CREA酶的作用下生成肌酸，肌酸在肌酸酶的作用下生成肌氨酸，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下生成過氧化氫，過氧化氫與過氧化物酶的存在使N-乙基-N-磺丁基-m-甲苯安鈉與4-氨基安替匹林氧化縮合產生醌色素。通過測定醌色素的吸光度，求出CREA的濃度。

本實驗室為ISO 15189認可實驗室，運行著一套完整且嚴格的質量管理體系，同時CREA項目全年參加衛生管理部門室間質評，結果成績優異，故在本實驗中CREA的檢測值與真實值之間的差距是由藥物干擾所導致。臨床實驗室研究干擾實驗是用來衡量方法的準確度，即在加入一定濃度的干擾物質后來明確干擾物質對結果的差異。干擾物質的濃度不同，造成的結果誤差也不同。根據EP7-A2文件[5]和文獻生物變異[6]提供的方案將本研究分為干擾篩選實驗和干擾劑量效應實驗，先利用干擾篩選實驗在高濃度下對干擾物作初步篩選，在確定酚磺乙胺為干擾物質后，再進一步利用干擾劑量效應實驗評估干擾物濃度與干擾程度的關系，分析酚磺乙胺對CREA項目造成干擾的原因。干擾劑量效應實驗選取的藥物濃度是依據酚磺乙胺的動力學特點盡可能選擇藥物進入人體后所能夠達到的峰值水平，模擬藥物濃度在人體的相對濃度，從而保證實驗的真實性、準確性。干擾實驗的臨床dmax并無明確指標，在EP7-A2文件[5]和文獻生物變異[6]中提出了一些參考的依據，包括部分分析物的準確度要求（總允許誤差）、基于生物學變異的質量規范以及臨床專家的意見等。本研究綜合以上各因素確定選用基于生物學變異的質量規范中允許總誤差的期望值作為干擾實驗dmax。

本實驗結果顯示，干擾篩選實驗dabs=-237.16 μmol/L，dabs 95%CI為-237.16±1.82 μmol/L，∣dabs95%CI∣>dmax，提示酚磺乙胺對酶法檢測血清CREA存在嚴重的負干擾。查閱文獻并結合CREA酶法原理發現[16]，血清中的CREA是在酶的催化作用下生成H2O2，H2O2又繼續參與Trinder反應從而形成紅色醌亞胺化合物，通過比色最后得出結果。H2O2酶的特異性較低，一些還原性物質可與色原性物質競爭H2O2，從而干擾氧化酶法的測定。酚磺乙胺是一種強還原性藥物，可促使酶法反應過程中的過氧化氫消耗，從而抑制酶法反應過程中的色酚氧化顯色，造成CREA測定假性降低而產生負干擾，導致醫生對患者腎功能的評估受到影響[17-18]。干擾劑量效應實驗分析結果得出，酚磺乙胺藥物濃度越高對CREA檢測結果的負干擾越大，在低、高濃度CREA樣本中，酚磺乙胺的濃度分別在9.73和1.17 mg/L以上時，負干擾程度高于預設的dmax 95%CI。

由酚磺乙胺藥代動力學特性可知，靜注后1 h血藥濃度可達到高峰，作用持續4～6 h，平均峰值300 mg/L，血液中半衰期為5 h，8個半衰期排泄99.61%。根據酚磺乙胺濃度與CREA干擾效應曲線方程得出酚磺乙胺對CREA能夠產生干擾所需的最小濃度為血藥峰值濃度的0.39%～3.24%，為盡量避免酚磺乙胺對CREA檢驗結果的干擾，建議使用酚磺乙胺的患者檢測CREA時，應在用藥后至少48 h再進行抽血檢測。而對于腎功能不全的患者，酚磺乙胺代謝所需的時間會更長，需要更長時間關注其對檢驗結果所造成的干擾。

鑒于酚磺乙胺對檢測血清CREA時造成的干擾，建議使用酚磺乙胺患者的在進行腎功能檢測時務必告知醫生服用此藥物的情況，必要時可進行血藥濃度檢測或等體內藥物代謝完全后再進行相關檢測[19-20]。作為實驗室醫生，當發現患者使用酚磺乙胺或者患者的CREA結果與上次相比較有明顯下降的趨勢時，要考慮可能是藥物干擾影響了檢測結果，必要時可采取其他的檢測方法進行復檢，以便對患者腎功能做出正確客觀的評價。

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（收稿日期：2020-02-06）