鹽酸地芬尼多片的有關物質分析

陳珉珉 唐小鵬 吳澤君

[摘要]目的 對國內上市的鹽酸地芬尼多片與原研片的有關物質進行對比分析。方法 采用《中華人民共和國藥典》2015版二部收載的鹽酸地芬尼多片有關物質測定方法，對其進行測定，同時結合強制降解試驗對比分析其有關物質情況。結果 雜質Ⅰ的檢出限為2.8 ng，定量限為9.7 ng;鹽酸地芬尼多溶液在18 h內穩定，各雜質及主峰峰面積相對標準偏差（RSD）均<2%;雜質Ⅰ質量濃度在0.4829～48.2900 μg/ml范圍內與峰面積線性良好（R2=1）;雜質Ⅰ精密度試驗，峰面積RSD為4.2%（n=12）;雜質Ⅰ平均回收率（n=6）為102.6%，RSD為2.0%;國內首仿廠家的兩批次片劑未檢出雜質，另一批檢出已知雜質Ⅰ，含量為0.14%;原研廠家兩批次未檢出雜質，另一批檢出雜質Ⅰ，含量為0.10%;其他三個廠家的片劑均檢出雜質Ⅰ，含量在0.2%～0.5%內。國內首仿廠家與原研廠家片劑在光照、氧化、熱及堿破壞條件下有關物質均無顯著變化，在酸破壞條件下主峰降解明顯，降解15%，雜質Ⅰ增加15%。結論 國內首仿廠家與原研廠家片劑有關物質一致，且在強制降解試驗中雜質降解行為一致;另三家企業片劑的已知雜質Ⅰ含量較原研廠家偏高2～5倍。

[關鍵詞]鹽酸地芬尼多片;有關物質;高效液相色譜法;鹽酸地芬尼多

[中圖分類號] R917 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2020）8（c）-0041-05

[Abstract] Objective To evaluate the consistency of related substances between the domestically marketed Difenidol Hydrochloride Tablets and reference preparations. Methods The related substances of Difenidol Hydrochloride Tablets were determined and evaluated according to the official quality standard recorded in Pharmacopoeia of the People′s Republic （2015 edition， version 2）. The forced degradation test was also carried out. Results The detection limit of impurity Ⅰ was 2.8 ng， and the quantitative limit was 9.7 ng. The solution of Difenidol Hydrochloride was stable in 18 hours， and the relative standard deviation （RSD） of impurities and main peak area was less than 2%. The linearity range of impurity Ⅰ was 0.4829-48.2900 μg/ml （R2=1）. In the precision test of impurity Ⅰ， the RSD of peak area was 4.2% （n=12）. The average recovery of impurity Ⅰ （n=6） was 102.6%， and RSD was 2.0%. No impurities were detected in two batch tablets of the first domestic manufacturer. The content of impurities Ⅰ was 0.14% in another batch. No impurities were detected in two batch tablets of the original manufacturer. The content of impurities Ⅰ was 0.10% in another batch. The content of impurities Ⅰ was among 0.2%-0.5% in the other three domestic manufacturers′ tablets. Under the conditions of light， oxidation， heat and alkaline damage， there was no significant change in the related substances between the first domestic imitator and the original manufacturer′s tablets. Under the acid damage condition， the degradation of the main peak was 15%， and the increase of impurity Ⅰ was 15%. Conclusion Impurity profiling of the first generic preparations is consistent with the reference preparations. For other three domestic manufacturers， impurity Ⅰ content is 2-5 times higher than that of the reference preparations.

[Key words] Difenidol Hydrochloride Tablets; Related substances; High performance liqiud chromatography; Difenidol Hydrochloride

鹽酸地芬尼多片收載于《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2015年版二部[1]，用于防治多種原因引起的眩暈、惡心、嘔吐，屬甲類非處方藥（over the counter，OTC）品種，入選國家基本藥物目錄[2]。原研片生產廠家是日本新藥工業株式會社，該藥于20世紀80年代由湖南千金湘江藥業有限公司率先仿制成功，目前其片劑市場占有率達70%。2016年5月，國家食品藥品監督管理總局發布“關于落實《國務院辦公廳關于開展仿制藥質量和療效一致性評價的意見》有關事項的公告”明確規定鹽酸地芬尼多片在公布的2018年底須完成仿制藥一致性評價289個品種目錄位列95號。除體外溶出一致性外[3]，有關物質一致性也是仿制藥質量一致性評價的重要組成部分[4-7]。目前鹽酸地芬尼多片有關物質方面已有的研究[8-13]主要是國內仿制片雜質的情況，并沒有分析原研片的有關物質，且沒有進行兩者對比分析其有關物質情況，無法判斷仿制品與原研品有關物質是否具有一致性。本研究收集了國內市場上該品種的幾個批次產品和原研片，參照國家發布的《化學藥物雜質研究技術指導原則》和《化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》及相關文獻資料[14-16]，對鹽酸地芬尼多片、原研片按照《中國藥典》[1]收載的質量標準測定了有關物質，分析其有關物質情況。

1儀器與試藥

1.1儀器

Ultimate3000高效液相色譜儀（配有DIONEX二極管陣列檢測器，賽默飛世爾科技有限公司）;MS205DU電子分析天平（感量為0.1 mg和0.01 mg，梅特勒-托利多有限公司）。

1.2試藥

鹽酸地芬尼多（湖南千金湘江藥業有限公司，批號：160311）;鹽酸地芬尼多片，仿制企業（湖南千金湘江藥業有限公司，規格：25 mg/片，批號：160305、160306、160307;廣西大海陽光藥業有限公司，批號：170201、170901;江蘇四環生物制藥有限公司，批號：1612071、1702161;山東仁和堂藥業有限公司，批號：160501、160901）;鹽酸地芬尼多片，原研（日本新藥工業株式會社，規格：25 mg/片，批號：381501、381601、381701）;鹽酸地芬尼多對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100841-201303，含量：99.6%），鹽酸地芬尼多雜質Ⅰ（烯化合物）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號101133-201101，含量：99.7%），甲醇（色譜純，Honeywell）。

2方法

2.1有關物質測定方法

采用《中國藥典》2015年版二部[1]收載的鹽酸地芬尼多片檢測有關物質方法[16]，條件如下。色譜柱：Aglient plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調節pH值至4.0）-甲醇（44∶56）;流速：1.0 ml/min;柱溫：30℃;檢測波長：210 nm;進樣量：20 μl;記錄時間為鹽酸地芬尼多主峰保留時間的4倍。

2.2溶液配制

2.2.1供試品溶液 ?取研細的鹽酸地芬尼多片粉末（約相當于25 mg鹽酸地芬尼多），精密稱定，置50 ml量瓶中，加流動相適量，振搖使鹽酸地芬尼多溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，續濾液作為供試品溶液。

2.2.2對照溶液 ?另取雜質Ⅰ對照品12.5 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質Ⅰ對照品溶液;精密量取2 ml及“2.2.1”下供試品溶液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，續濾液作為對照溶液。

2.2.3空白輔料溶液 ?取不含主藥成分按處方比例制備的空白片（湖南千金湘江藥業有限公司提供），按“2.2.1”供試品溶液配制。

2.3專屬性試驗

分別取“2.2”項下的空白輔料溶液、供試品溶液及對照溶液，按“2.1”項有關物質測定方法，進樣測定，記錄色譜圖。

2.4檢出限與定量限

稱取空白輔料1.0 g，兩份，分別加入1.5 和4.0 ml的對照溶液，按“2.2”項下的供試品溶液制備法操作，進樣測定，計算信噪比（S/N），基于S/N為3和10時分別計算檢出限與定量限。

2.5耐用性

取酸破壞試驗的樣品溶液，分別考察“2.1”項下的色譜條件波長變化±2 nm、柱溫變化±5℃、流速變化±20%、流動相pH值變化±0.2和流動相比例甲醇變化±2%時，雜質檢出情況變化。

2.6溶液穩定性

取“2.2”項下的供試品溶液和對照溶液在室溫下放0、3、6、12、18 h，分別進樣，考察主峰面積及雜質峰面積變化情況。

2.7雜質Ⅰ線性試驗

精密稱取12.11 mg雜質Ⅰ置于50 ml量瓶中，加流動相稀釋溶解，定容至刻度，搖勻。再分別精密量取0.2、0.4、1、2、4、10、20 ml溶液置于100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣分析。以峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸分析。

2.8雜質Ⅰ重復性試驗

取湖南千金湘江藥業有限公司的鹽酸地芬尼多片劑（批號：160307）研細粉，精密稱定6份，照“2.2”項下配置溶液，共6份，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算雜質Ⅰ的含量及相應的相對標準偏差（RSD）。

2.9雜質Ⅰ精密度試驗

由不同的實驗人員，采用不同的儀器與色譜柱，按照“2.2”項下配置溶液，共6份，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算雜質Ⅰ的含量，并結合重復性試驗結果一起計算相應的RSD。

2.10雜質Ⅰ回收率試驗

稱取空白輔料約0.125 g，6份，各加入“2.2”項下的雜質Ⅰ對照品溶液1 ml，依法配制6份溶液，進樣測定。記錄色譜圖，計算回收率。

2.11強制降解對比試驗

根據穩定性試驗指導原則[17-18]，取鹽酸地芬尼多原料藥、空白輔料、仿制片（湖南千金湘江藥業有限公司提供）及原研片細粉各適量（相當于250 mg鹽酸地芬尼多），精密稱定，分別置于100 ml量瓶中，加流動相適量，振搖使鹽酸地芬尼多溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為貯備液;分別精密量取上述各貯備液2 ml，①加1 mol/L鹽酸溶液0.8 ml，置40℃水浴中放置0.5 h，最后再加1 mol/L氫氧化鈉溶液調至中性;②加1 mol/L氫氧化鈉溶液0.8 ml，置60℃水浴中放置1 h，最后再加1 mol/L鹽酸溶液調至中性;③經4500LX光照24 h;④加30%過氧化氫溶液0.8 ml，置水浴（60℃）中放置1 h;⑤置沸水浴中放置1 h;再分別加流動相稀釋定容至10 ml，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液進樣分析。

2.12有關物質測定

采用經驗證的有關物質測定方法，對日本原研產品和國內上市同品種進行有關物質分析。

3結果

3.1專屬性試驗結果

專屬性試驗結果表明，空白輔料、鹽酸地芬尼多、雜質Ⅰ互不干擾，分離度符合《中國藥典》（2015年版四部）[17]要求，色譜圖見圖1。

3.2檢出限與定量限結果

“2.4”項試驗結果表明，鹽酸地芬尼多的檢出限為2.8 ng，定量限為7.0 ng;雜質Ⅰ的檢出限為2.8 ng，定量限為9.7 ng。

3.3耐用性結果

耐用性試驗結果表明，在各變動色譜條件下，主峰與雜質峰、雜質峰之間分離良好，方法的耐用性好，具體見表1。

3.4溶液穩定性結果

穩定性試驗結果表明，鹽酸地芬尼多溶液室溫下放置18 h，主峰面積及雜質峰面積的RSD均<2%;雜質譜特征一致，溶液穩定性良好。

3.5雜質Ⅰ線性試驗結果

線性試驗結果表明，雜質Ⅰ在0.4829～48.2900 μg/ml范圍內線性關系良好，回歸方程為A=1.6526C+0.0086（R2=1）。

3.6雜質Ⅰ重復性試驗結果

重復性試驗結果表明，6次測定雜質Ⅰ含量RSD為4.6%（n=6），方法重復性良好。

3.7雜質Ⅰ精密度試驗結果

精密度試驗結果表明，12次測定雜質Ⅰ含量RSD為4.2%（n=12），精密度良好。

3.8雜質Ⅰ回收率試驗結果

回收率試驗結果表明，平均回收率為102.6%，符合要求，具體見表2。

3.9強制降解對比試驗結果

強制降解對比試驗結果表明，空白輔料性質穩定，在強制降解條件下不影響鹽酸地芬尼多的穩定性;鹽酸地芬尼多仿制片和原研片在光照、氧化、熱及堿破壞條件下有關物質均無顯著變化，在酸破壞條件下主峰降解明顯，降解15%，雜質Ⅰ增加15%，基本實現物料平衡，主峰純度符合要求。仿制片和原研片在強制降解試驗中雜質降解行為一致。對比圖譜具體見圖2～6。

3.10有關物質測定結果

有關物質測定結果表明，湖南千金湘江藥業有限公司仿制片與原研片有關物質一致，檢出的已知雜質Ⅰ含量與原研片檢出的含量相當。廣西大海陽光藥業有限公司有一批次檢出未知雜質，且含量>0.2%，其他企業各批次檢出的雜質Ⅰ含量偏高，但總體結果均符合《中國藥典》[1]規定限度（雜質Ⅰ不得超過1.0%，其他各雜質總和不得超過1.0%），具體見表3。

4討論

本研究對國內市場上首仿企業的仿制片（市場占有率近70%）及其他三家國內企業的同規格制劑與原研片進行了有關物質對比分析。選用的方法為《中國藥典》[1]收載的高效液相色譜法?！度毡舅幍洹?7版[19]和《韓國藥典》第10版[20]收載的鹽酸地芬尼多質量標準，其中檢測有關物質的方法為薄層色譜法，通過比較供試品出現的除主峰外其他的斑點不得深于標準斑點，來判斷有關物質是否符合標準，此法不能準確定量雜質Ⅰ的含量，且難以檢出其他微量雜質，使用了有毒試劑甲苯，靈敏度低。高效液相色譜法可準確定量雜質Ⅰ含量，靈敏度高，且能檢出其他雜質，所以最后選定此法開展實驗。

原研片中的有關物質，三批僅其中一批檢出了雜質Ⅰ，且含量<0.2%，其他兩批未檢出任何雜質。湖南千金湘江藥業有限公司仿制片有關物質與原研片基本一致。且結合兩者的強制降解對比試驗結果，首仿片和原研片雜質降解行為一致。因此可判斷首仿制劑有關物質質量與原研片一致?？疾斓钠渌移髽I仿制片雜質Ⅰ含量高出原研片的2～5倍，且其中一批檢出了未知雜質，含量超過0.2%。課題組還對該制劑的體外溶出進行了相關研究[3]，結合有關物質分析結果，國內該制劑的生產廠家還需改進制劑處方工藝，以使其達到與原研片內在質量一致。

現行的《中國藥典》[1]規定該片劑中雜質Ⅰ不得超過1.0%，其他各雜質總和不得超過1.0%，根據樣品測定結果建議把雜質Ⅰ的限度修訂為不得超過0.5%，促使企業提高該制劑的質量水平。

本研究采用的測定方法專屬性強，靈敏度高，線性、精密度、穩定性、準確度均良好;國內首仿廠家與原研廠家片劑有關物質一致，且在強制降解試驗中雜質降解行為一致;另三家企業片劑的已知雜質Ⅰ含量較原研廠家偏高2～5倍。

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（收稿日期：2020-01-21）