HPLC法同時(shí)測(cè)定生脈飲中3種成分的含量

王永紅 原歡歡 王雪瑩

[摘要]目的 建立同時(shí)測(cè)定生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 采用Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱;甲醇-水（72∶28）為流動(dòng)相;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;流速為1.0 ml/min。結(jié)果 五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素進(jìn)樣量分別在0.5975～9.5600 μg（r=0.9999）、0.0750～1.1990 μg（r=0.9998）、0.1888～3.0210 μg（r=0.9999）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，加樣平均回收率分別為99.3%、98.9%、98.6%，RSD分別為0.9%、1.5%、1.2%。對(duì)天誠(chéng)制藥的5批次生脈飲樣品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]生脈飲;高效液相色譜法;五味子醇甲;五味子甲素;五味子乙素

[中圖分類號(hào)] R286 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2020）8（c）-0046-04

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination on the components of schizandrin A， deoxyschizandrin， schizandrin B in Shengmaiyin. Methods An Agilent Eclipse Plus C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column was used， methanol-water （72∶28） was used as the mobile phase， the column temperature was 30°C， the detection wavelength was 254 nm， and the flow rate was 1.0 ml/min. Results The sample size of schisandrin A， deoxyschizandrin， and schisandrin B showed a good linear relationship within the range of 0.5975-9.5600 μg （r=0.9999）， 0.0750-1.199 μg （r=0.9998）， and 0.1888-3.0210 μg （r=0.9999）， with good precision， stability， and repeatability， the average recovery rate of sample addition was 99.3%， 98.9%， 98.6%， and the RSD was 0.9%， 1.5%， 1.2%， respectively. The contents of schisandrin A， deoxyschizandrin， and schisandrin B in 5 batches of Shengmaiyin samples from Tiancheng Pharmaceutical Co.， Ltd. were determined， and the results were stable. Conclusion This method is simple， accurate， simple and stable， and can be used for the determination of schisandrin A， deoxyschizandrin and schisandrin B in Shengmaiyin.

[Key words] Shengmaiyin; High performance liquid chromatography; Schisandrin A; Deoxyschizandrin; Schizandrin B

生脈飲，又名生脈散，由紅參、麥冬、五味子3味中藥組成，具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津之功效。用于氣陰兩虧、心悸氣短、脈微自汗[1]。生脈飲有廣闊的市場(chǎng)前景，收載于《中華人民共和國(guó)藥典》[1]（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）一部2015版，其主要有效成分為皂苷類、多糖類、黃酮類、木脂素類等物質(zhì)，其中，木脂素類等物質(zhì)為五味子的主要成分[2-3]。雖然高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）法可同時(shí)測(cè)定生脈飲中7種木脂素的含量[4-5]，但該方法要求較高，運(yùn)用較受限。HPLC法應(yīng)用更廣泛，但目前僅有單獨(dú)測(cè)定五味子醇甲[6-12]或同時(shí)測(cè)定五味子甲素和五味子乙素兩種成分[13]的研究報(bào)道;測(cè)定五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的相關(guān)報(bào)道較少。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]，建立了同時(shí)測(cè)定生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量的HPLC方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1主要儀器與材料

Agilent1260-DAD HPLC儀（安捷倫）;TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀）;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市華特）;METTLER AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多）;甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸餾水;五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：110857-201412）、五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)：110764-201513）、五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)：110765-201512）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;生脈飲（太極集團(tuán)·四川天誠(chéng)制藥有限公司，規(guī)格：10 ml×10支）;陰性樣品（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2方法

1.2.1色譜條件 ?色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：30℃;流動(dòng)相：甲醇-水（72∶28）;流速：1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備 ?精密稱取對(duì)照品，用甲醇制備成混合對(duì)照品溶液（濃度分別為478.00、59.96、151.04 μg/ml）。

1.2.3供試品溶液的制備 ?精密量取生脈飲20 ml，置于分液漏斗中，用正己烷萃取5次，30 ml/次，離心，合并正己烷層，85℃水浴蒸干，固體用甲醇溶解并定容至5 ml，搖勻，取濾液既得。

1.2.4陰性樣品溶液的制備 ?取按照生脈飲處方配制不含五味子的陰性樣品，依“1.2.3”項(xiàng)下方法制備既得。

1.2.5專屬性實(shí)驗(yàn) ?按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液及“1.2.4”項(xiàng)下陰性樣品溶液，分別注入HPLC儀，進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。

1.2.6線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) ?精密取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋制成5個(gè)濃度梯度，按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，注入HPLC儀，以進(jìn)樣量X（μg）對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7精密度實(shí)驗(yàn) ?按照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次的色譜峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) ? 按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24 h依次進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn) ?取生脈飲（批號(hào)：17120014）樣品，按照“1.2.3”項(xiàng)下制備方法平行制備6份，按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD值。

1.2.10加樣回收率實(shí)驗(yàn) ?精密量取6份已測(cè)含量的生脈飲（批號(hào)：17120014）各10 ml，再加入不同量按照“1.2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和“1.2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加樣回收率。

1.2.11樣品含量測(cè)定 ?按照上述所建方法，測(cè)定太極集團(tuán)·四川天誠(chéng)制藥有限公司所生產(chǎn)的5批次生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量。按照“1.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算含量。

2結(jié)果

2.1專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.5”項(xiàng)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，陰性樣品溶液在供試品溶液主峰處無干擾（圖1），方法專屬性良好。

2.2線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.6”項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素分別在0.5975～9.5600、0.0750～1.1990、0.1888～3.0210 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（表1）。

2.3精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.7”項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，連續(xù)進(jìn)樣6次五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為1.3%、0.6%、1.1%，提示儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.8”項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，供試品溶液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、1.5%，提示樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.9”項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量（n=6）的RSD均<2.0%，提示該方法重現(xiàn)性良好。

2.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照“1.2.10”項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，本方法檢測(cè)生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量的平均回收率分別為99.3%、98.9%、98.6%，且RSD值均<2.0%。

2.7樣品測(cè)定結(jié)果

按照“1.2.11”項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定天誠(chéng)制藥5個(gè)批次生脈飲樣品五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量，結(jié)果顯示，5批次生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的平均含量分別為39.87、4.63、11.24 μg/ml（表3）。

3討論

生脈飲療效確切，擁有廣闊的市場(chǎng)前景。但現(xiàn)行HPLC檢測(cè)方法中僅有單獨(dú)測(cè)定五味子醇甲或同時(shí)測(cè)定五味子甲素和五味子乙素兩種成分的研究。為保證生脈飲產(chǎn)品質(zhì)量，本研究建立了對(duì)生脈飲的質(zhì)量控制方法，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定生脈飲中3種有效成分（五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素）的含量。

本實(shí)驗(yàn)建立生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)單、陰性無干擾、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5批生脈飲中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的平均含量分別為39.87、4.63、11.24 μg/ml。本實(shí)驗(yàn)可為生脈飲中質(zhì)量控制研究提供理論依據(jù)，更可為全面反映藥品質(zhì)量和其他制劑研究提供借鑒。

實(shí)驗(yàn)過程中還進(jìn)行了色譜柱和流動(dòng)相對(duì)比實(shí)驗(yàn)（由于篇幅所限，結(jié)果中并未全部列舉），其中色譜柱分別采用Thermo Syncronis C18、Agilent Eclipse Plus C18和Welch Ultimate XB-C18，結(jié)果顯示，Agilent Eclipse Plus C18的分離測(cè)定效果最佳，重復(fù)性、穩(wěn)定性也都更好。流動(dòng)相對(duì)比實(shí)驗(yàn)分別使用甲醇-水（77∶23）、（13∶7）、（62∶38）和（72∶28），結(jié)果顯示，甲醇-水（72∶28）更適合同時(shí)測(cè)定五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素。