一種基于嗎啉衍生物的Fe3+/Cu2+熒光探針

羅杰偉 趙 波 張仕祿 賈飛云 劉 軍

(川北醫學院基礎醫學院，南充 637000)

近年來，離子識別因其精確靈敏的檢出極限和豐富多元的響應信號在信息學、生物診斷試劑與診斷醫藥學等領域具有極大的應用潛力[1-3]。在各種重金屬中，鐵和銅是人體中豐富的微量元素，鐵離子和銅離子參與了很多細胞的生物及化學過程。如Fe3+作為血紅蛋白、肌紅蛋白和各種酶形成的重要組成部分，參與了細胞水平上的許多生物和化學過程[4]。但過多的Fe3+和Cu2+卻給人的身體健康帶來傷害。如過量的Fe3+會破壞蛋白質、肝臟、DNA等，從而引發多種疾病[5]。Cu2+過量不僅導致一些如威爾遜病、孟克斯病、帕金森病和阿爾茨海默病等神經退行性疾病，還會引起腸道疾病和肝腎損害[6]。對于正常的生理機能而言，要求體內的Fe3+和Cu2+處于平衡狀態，因此，設計熒光傳感器探測Fe3+和Cu2+成為目前的研究熱點之一[7-11]。

嗎啉衍生物是一類重要的六元含氮雜環化合物，在農藥、醫藥等生物和非生物領域都具有非常重要的應用價值與廣闊的應用前景[12-13]。嗎啉環上氧原子可以參與相應受體的供體-受體型相互作用，增加結合緊密性；另外，氧原子的高電負性降低了氮原子的堿性[14]。嗎啉基團的特殊性使得許多科研工作者致力于嗎啉衍生物的合成與性能研究，但目前關于嗎啉衍生物同時對Fe3+和Cu2+具有選擇性識別的報道還很少[15-18]。鑒于此，我們合成了一種熒光分子探針4-((3-(1-苯基-5-吡啶基-4，5-二氫-1H-吡唑-3-基)蒽-9-基)甲基)嗎啉(L)，利用熒光發射光譜和紫外吸收光譜研究了探針L的離子識別性能。還測定了L在Fe3+、Cu2+和H+不同組合條件下的量子產率，構建了三輸入“NOR”邏輯門電路。結果表明，通過儀器檢測和裸眼可以判斷探針L選擇性識別Fe3+和 Cu2+。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所用儀器有：ZFQprobe L5A型旋轉蒸發儀(四川康宇科技公司)、Avatar 360型紅外光譜儀(KBr壓片，Nicolet公司)、XT-4型雙目顯微熔點測定儀(溫度計未經校正，北京泰克公司)、AdvanceⅢ400 Hz核磁共振儀(Bruker公司)、UV2550型紫外分光光度儀(Shimadzu公司)、RF-5301型熒光光度計、pHS-3C型酸度計(上海精科實業有限公司)。9-乙酰基蒽、嗎啉、1，4-二氧六環、苯肼、三溴化磷、吡啶甲醛等均為分析純，購自科龍化學試劑公司。硼氫化鈉為進口袋裝。金屬離子溶液所用金屬鹽均為高氯酸鹽水合物。測試中所用的乙腈為色譜純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 熒光探針L的合成

合成路線如Scheme 1所示。

Scheme 1 探針L的合成路線Scheme 1 Synthetic route for probe L

1.2.1 4-(9-蒽甲基)嗎啉(3)的合成

化合物 9-蒽醇(1)和 9-溴甲基蒽(2)參照文獻[19]合成。在250 mL圓底燒瓶中加入2(5 g，18.45 mmol)、無水K2CO3(7.65 g，55 mmol)、80 mL無水CH3CN和少量KI，攪拌回流9 h。冷卻至室溫，抽濾，旋蒸除去溶劑。用二氯甲烷和石油醚(1∶4，V/V)重結晶得到黃色顆粒狀固體4.1 g。產率：80.4%，m.p.142～144℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.61～2.64(t，J=4.6 Hz，4H，-N-CH2-)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz，4H，-OCH2-)，4.46(s，2H，Ar-CH2-)，7.46～7.56(m，4H，Ar-H)，8.00～8.03(m，2H，Ar-H)，8.44(s，1H，Ar-H)，8.48～8.49(d，J=4 Hz，1H，Ar-H)，8.51(s，1H，Ar-H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 53.65,54.54，67.11，76.77，77.09，77.41,124.84,124.99，125.63，127.55，128.96，129.10，131.35，131.39。

1.2.2 1-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)乙酮(4)的合成

在250 mL三頸瓶中加入3(1 g，3.6 mmol)、乙酰氯(1.7 g，22 mmol)和50 mL無水二氯甲烷，冰鹽浴條件下攪拌，冷卻至-5～0℃時，分批加入0.96 g無水三氯化鋁，拆去冰浴，攪拌至溫度升到10℃。抽濾，無水二氯甲烷洗滌。將溶液緩慢加入到150 mL冰和濃鹽酸的混合溶液中，用二氯甲烷和水萃取，以飽和Na2CO3溶液洗至pH=7，無水MgSO4干燥。抽濾，旋蒸除去溶劑，粗產品經柱層析純化(V石油醚∶V二氯甲烷=4∶1)得黃色固體0.35 g。產率：30%，m.p.158～160℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.60～2.62(t，J=4.4 Hz，4H，-N-CH2-)，2.77(s，3H，-COCH3)，3.63～3.65(t，J=4.4 Hz，4H，-O-CH2-)，4.44(s，2H，Ar-CH2-)，7.51～7.63(m，2H，Ar-H)，8.03～8.07(m，2H，Ar-H)，8.49～8.53(m，2H，Ar-H)，8.58(s，1H，Ar-H)，8.64～8.65(d，J=4 Hz,1H，Ar-H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 26.44,53.52，54.42，66.97，122.86，124.99，125.44，125.58，126.91,129.17,130.06,131.69,132.23，132.90，133.37。

1.2.3 1-(10-(嗎啉甲基)蒽-2-基)-3-吡啶基丙基-2-烯-1-酮(5)的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入7 g KOH、10 mL水和50 mL 95%乙醇，冷卻至室溫。加入4(0.638 g，2 mmol)和吡啶甲醛(0.321 g，3 mmol)，在15 ℃下攪拌3 h。過濾，水洗，用無水乙醇重結晶得黃色固體0.425g。產率：64%，m.p.145～148℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.65(t，J=4.6 Hz，4H，-N-CH2-)，3.67(t，J=8 Hz，4H，-O-CH2-)，4.45(s，2H，Ar-CH2-)，7.33～7.37(m，1H)，7.52～7.56(m，2H),7.60～7.64(m,1H),7.77～7.81(m，1H)，7.87～7.91(d，J=16 Hz，1H)，8.06～8.08(d，J=8 Hz，1H)，8.17～8.20(m，1H)，8.36～8.40(d，J=16 Hz，1H)，8.51～8.58(m，2H)，8.64(m，1H)，8.75～8.77(m，1H)，8.86～8.87(d，J=4 Hz，1H)。

1.2.4 L的合成

50 mL圓底燒瓶中加入5(0.5 g，1.5 mmol)和10 mL無水乙醇，加熱至溶解，加入苯肼(0.199 g，1.18 mmol)和一粒氫氧化鈉，攪拌回流16 h。冷卻至室溫，加適量水析出黃色固體。抽濾，水洗，用無水乙醇重結晶得黃色固體0.27 g。產率：42%，m.p.276～278 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ 2.61～2.63(t，J=4.6 Hz，4H，-N-CH2-)，3.46(s，1H)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz,4H,-O-CH2-),4.07(s，1H)，4.44(s，2H，Ar-CH2-)，5.53～5.58(m，1H)，6.82～6.86(m，1H，Ar-H)，7.14～7.16(m，2H，Ar-H)，7.19～7.21(m，1H，Ar-H)，7.23(s，1H，Ar-H)，7.24～7.25(d，J=4 Hz，1H，Ar-H)，7.26～7.28(m，1H，Ar-H)，7.46～7.55(m，2H，Ar-H)，7.59～7.63(m，1H，Ar-H)，7.86～7.87(d，J=4 Hz，1H，Ar-H)，7.96～8.00(m，1H，Ar-H)，8.24～8.27(m，1H，Ar-H)，8.25(s，1H，Ar-H)，8.45～8.48(m，2H，Ar-H)，8.65～8.67(m，1H，Ar-H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 41.64，53.55，54.44，65.73，67.03，113.20，119.30，120.24，122.53，123.32，124.98,125.13,125.24,125.37,125.86，125.96，127.78，128.84，129，129.16，129.25，131.00，131.05，131.70，131.75，137.41，144.30，146.96，149.65，161.49。

1.3 離子識別實驗

1.3.1 溶液配制

稱量4.9 mg(0.01 mmol)L于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，濃度為0.1 mmol·L-1。配制含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ag+、Fe3+、Ni2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Zn2+、Hg2+等離子的高氯酸鹽溶液，濃度為0.1 mmol·L-1。

1.3.2 光譜測定

移取0.1 mL的L溶液分別置于10 mL容量瓶中，分別加入0.1 mL各種陽離子溶液，稀釋至10 mL(濃度為1 μmol·L-1)，搖勻，靜置24 h。室溫下，在激發波長360 nm、狹縫寬度(d)5 μm的條件下測定其熒光發射強度。以乙腈溶液為參比溶液，在波長為200～600 nm條件下測定主-客體混合液的紫外吸收強度。

2 結果與討論

2.1 探針L對陽離子的識別

圖1 加入不同陽離子后L在乙腈中的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of L after adding various cations in acetonitrile

如圖1所示，在360 nm激發波長下，Fe3+和Cu2+對探針L表現出較強的熒光猝滅，其他離子對L無影響。當加入Fe3+后，L的熒光強度從650變為215，最高峰位置從540 nm紅移到567 nm。加入Cu2+后，L的熒光強度從650變為110，最高峰位置不變。同時，L溶液的顏色分別從淡黃色變為棕褐色和藍色(圖2)，裸眼很容易判斷L選擇性識別Fe3+和Cu2+。

圖2 在L的乙腈溶液中加入不同離子后的顏色變化Fig.2 Color changes of L in acetonitrile after adding various ions

2.2 探針L的熒光滴定

圖3 加入不同濃度Fe3+后L在乙腈中的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of L in acetonitrile upon addition of iron ion with different concentrations

圖4 加入不同濃度Cu2+后L在乙腈中的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of L in acetonitrile upon addition of copper ion with different concentrations

鑒于L對Fe3+和Cu2+具有較好的識別效果，用Fe3+和Cu2+對L進行熒光滴定。實驗發現，隨著Fe3+濃度的增加，峰的強度逐漸減小并向長波方向移動；峰強從650降至123，降低了527；峰位從540 nm移到了582 nm，紅移了42 nm；在425 nm處出現了一個小峰，但峰強度很小(圖3)。紅移原因可能是吡啶環和吡唑環上的N都參與了配位，熒光淬滅被抑制。圖4顯示，隨著Cu2+濃度的增加，L的熒光光譜在540 nm處的峰強逐漸降低到0，同時在425 nm處出現了一個新的峰，強度從0升至105。通過Job曲線法求得L與Fe3+和Cu2+的配位比均為1∶1。可能是L環上雜原子作為軟給體原子與軟/硬酸Fe3+和Cu2+發生了配位作用。

2.3 探針L與Fe3+/Cu2+配位反應的抗干擾測定

為了考察其它陽離子對 L(1.0 μmol·L-1)與 Fe3+和Cu2+配位反應的影響，研究了Fe3+和Cu2+與其他金屬離子共存時L在540 nm處的熒光變化(圖5)。結果證實，在其它陽離子共存時也不影響L同時識別Fe3+和Cu2+，說明L對Fe3+/Cu2+具有較強的選擇性識別。

圖5 Fe3+、Cu2+與其他離子共存時L的熒光強度Fig.5 Fluorescence intensity of L when Fe3+and Cu2+coexist with other ions

2.4 探針L的抗酸性實驗

圖6顯示，由于嗎啉環上O原子為電負性，N原子是三級N且吡啶環上N原子富電子性，L受pH的影響很大。當pH≤4時，熒光淬滅完全；pH＞4時，熒光強度沒有變化，說明嗎啉環上O原子、N原子以及吡啶環上N原子容易質子化。結果表明，L在pH值為5～7時熒光強度基本不變，具有良好的傳感性能，可應用于生物領域。

圖6 不同pH值時L在乙腈中的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of L in acetonitrile with different pH values

2.5 探針L的紫外吸收性能

圖7顯示，L在267和380 nm有吸收峰。加入Fe3+后L的這2個吸收峰強度增大，加入Cu2+后L在267 nm的峰強度增大，在380 nm的峰強度減小，其它離子對L無影響。在Fe3+和Cu2+對L的紫外滴定實驗中，加入Fe3+后L在267和380 nm的強度逐漸增大(圖8)；加入Cu2+后L在267 nm的峰強也是逐漸增大，在380 nm的強度卻是逐漸減小，但強度變化都不明顯(圖9)。在H+對L紫外滴定實驗中，隨著pH值減小，紫外吸收強度逐漸減小。當pH≤4時，強度突然減小，吸收峰位藍移(圖10)。實驗證明探針L對Cu2+、Fe3+具有較強的選擇性識別。

圖7 加入不同陽離子后L在乙腈中的紫外光譜Fig.7 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile upon addition of various cations

圖8 加入不同濃度Fe3+后L在乙腈中的紫外光譜Fig.8 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile upon addition of iron ion with different concentrations

圖9 加入不同濃度Cu2+后L在乙腈中的紫外光譜Fig.9 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile upon addition of copper ion with different concentrations

圖10 在不同pH值時L在乙腈中的紫外光譜Fig.10 Ultraviolet spectra of L in acetonitrile with different pH values

2.6 探針L的NOR邏輯門研究

由于加入Fe3、Cu2+和H+后探針L熒光淬滅，考察了加入1種、2種或者3種離子組合時L的熒光強度變化。圖11顯示，加入Cu2+、Fe3+和H+不同的組合后，L釋放出不同的熒光輸出信號，因此，可利用L與Cu2+、Fe3+配位作用以及H+質子化作用產生的存儲功能構建NOR邏輯門。

在 L 的乙腈溶液(1.0 μmol·L-1)中分別加入 Fe3+(2.0 μmol·L-1)、Cu2+(2.0 μmol·L-1)和 H+(2.0 μmol·L-1)，在激發波長為360 nm下測其熒光強度。以蒽(1.0 μmol·L-1)為參比(室溫，Φf=0.36)，運用公式 Yu=(Ys×Fu×As)/(Fs×Au)計算出量子產率(表 1)，其中Yu為待測物質的量子產率，Ys為標準物質的量子產率，Fs為蒽的熒光積分強度，As為標準物質在360 nm時的紫外吸收峰的強度，Fu和Au分別為L的熒光積分強度和紫外吸收強度。

圖11 加入不同組合的Fe3+、Cu2+和H+后L在乙腈中的熒光強度Fig.11 Fluorescence intensity of L in acetonitrile upon addition of different combinations of Cu2+,Fe3+and H+

表1 在1.0 μmol·L-1的L的乙腈溶液中加入Fe3+、Cu2+和H+的不同組合時的量子產率Table 1 Fluorescence quantum yield of L upon addition of different combinations of Fe3+,Cu2+and H+in acetonitrile

規定量子產率數值大于0.3時輸出信號為1，小于0.3時輸出信號為0，即沒有離子存在時輸出信號為1；若Fe3+、Cu2+和H+中任何一種離子存在時，輸出信號為0，得到L的真值表(表2)。因此，在L溶液中加入不同組合的Fe3+、Cu2+和H+時滿足NOR邏輯門條件，可構建三輸入NOR分子邏輯門(圖12)。

圖12 L的NOR邏輯門循環示意圖Fig.12 Circulation diagram of NOR logic gate for L

表2 L的NOR邏輯門真值表Table 2 Truth table of NOR logic gate for L

2.7 探針L的識別機理研究

探針L對Fe3+和Cu2+具有較好識別效果且呈現“開-關”特性，主要原因是L中包含一個具有較高量子產率的熒光基團蒽，還包含電子給體吡唑上的氮，可向熒光基團發生PET過程；而金屬Fe3+、Cu2+含有空d軌道，當L結合Fe3+、Cu2+后，這2種離子本身又使得熒光基團的電子轉移到空d軌道，發生非輻射能量轉移過程或電子轉移過程，導致熒光淬滅。另外，根據軟硬酸堿理論，Fe3+、Cu2+在嗎啉環雜原子配位作用及芳環上π電子等弱非共價鍵的協同作用下能夠被主體很好地識別，可能是嗎啉環雜原子作為軟給體原子與軟金屬銅、鐵有強的親和力，分別形成Fe…O與Fe…N、Cu…O與Cu…N的五元環配合物(Scheme 2)[6,20-22]。隨著Fe3+濃度增加，L熒光強度逐漸降低并發生紅移，可能是由于吡啶環上N原子和吡唑環上N原子同時參與配位形成穩定六元環配合物，熒光淬滅被抑制。

Scheme 2 L對Fe3+(a)和Cu2+(b)的識別機理Scheme 2 Proposed recognition mechanism of L to Fe3+(a)and Cu2+(b)

3 結 論

合成了一種熒光分子傳感器嗎啉衍生物(L)，利用1H NMR、13C NMR表征了化合物結構，通過熒光發射光譜和紫外吸收光譜研究了L對陽離子的識別性能。結果表明，探針L對Fe3+和Cu2+具有較強的選擇性識別，量子產率分別為0.21和0.14；同時，L溶液顏色從淡黃色分別變為棕褐色和藍色，裸眼可判斷L選擇性識別Fe3+和Cu2+。L對Fe3+和Cu2+具有較強識別的原因，可能是L環上雜原子與Fe3+/Cu2+配位形成配合物過程中，發生非輻射能量轉移或電子轉移過程導致熒光淬滅，是一個典型“on-off”開關熒光化學傳感器。因此，L有望應用于農藥檢測、環境檢測、工業傳感、醫藥科學、毒品分析、生物學等領域檢測鐵離子和銅離子。

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