湖南湘潭縣及周邊地區(qū)屠宰生豬副豬嗜血桿菌流行情況調查與藥敏試驗

周 政，李慶豐

（1.湘潭市易俗河鎮(zhèn)農技農機畜牧水產推廣服務中心，湖南 湘潭 411228；2.湘潭縣錦石鄉(xiāng)人民政府農業(yè)服務中心，湖南 湘潭 411228）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,Hps）是一種在豬場十分常見、可導致生豬出現(xiàn)呼吸道癥狀的細菌性病原，又稱為豬格拉瑟氏病[1]。Hps常棲于豬上呼吸道，健康豬群感染該病不出現(xiàn)明顯臨床癥狀，只有豬群免疫力下降，如感染免疫抑制性病原（如藍耳病病毒、圓環(huán)病毒2型）或毒素慢性中毒等時，會出現(xiàn)關節(jié)炎、呼吸困難和神經癥狀等，且死亡率較高，可造成嚴重的經濟損失[2-3]。此外，臨床上對Hps的有效預防得益于抗生素的應用，但不合理使用抗生素易導致Hps產生耐藥性。田昊倫等[4]發(fā)現(xiàn)Hps陜西株對環(huán)丙沙星、氟苯尼考等敏感，但對林可霉素和青霉素等耐藥；池晶晶等[5]發(fā)現(xiàn)Hps天津株對青霉素和恩諾沙星等抗生素敏感，說明不同地區(qū)（豬場或環(huán)境）Hps耐抗生素種類和程度差異較大，而菌株藥物敏感試驗是篩選有效臨床用藥的必要手段。

湖南湘潭市畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達，其中生豬養(yǎng)殖在當?shù)剞r牧業(yè)占有重要地位[6]。近年來，湘潭市生豬養(yǎng)殖業(yè)呈現(xiàn)擴大化和規(guī)模化趨勢，但豬場Hps流行情況始終較為嚴重。近期筆者臨床接診Hps相關病例較多。為初步了解湘潭縣及周邊地區(qū)豬群Hps隱性感染情況，本研究對2019年4—9月收集來自湘潭縣某生豬屠宰場的120豬肺臟樣品進行Hps分離與分型，對具有代表性毒株進行藥敏試驗，以期為臨床上Hps防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年4—9月，筆者每月從湘潭縣某生豬屠宰場采集肥豬肺臟樣品20份，共120份。對樣品來源和采集日期進行標記，低溫保存送至湘潭縣動物疫病預防控制中心，待檢。

1.2 樣品處理與細菌分離鑒定

用無菌生理鹽水將樣品表面污物洗凈，用滅菌手術刀和眼科剪切開組織，取適量深層組織置于研缽，加入生理鹽水后研磨，蘸取上清組織液在含有10%乳牛血清的TSA固體培養(yǎng)基表面進行平板劃線，將培養(yǎng)基放置在恒溫（37℃）培養(yǎng)箱內24～36 h，對分離菌株進行革蘭氏染色鑒定，以確定樣品是否為副豬嗜血桿菌病陽性[7]。

1.3 Hps血清型鑒定及藥敏試驗

將革蘭氏染色鑒定初步確定為Hps的菌株進行擴增，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取菌株DNA，使用Hps 1～15型特異性引物對Hps菌株血清型進行多重鑒定，其中PCR反應條件及所用引物參考文獻[8]。對具有代表性血清型的Hps菌株進行抗生素敏感試驗：將菌株擴增，適量稀釋后涂布在固體培養(yǎng)基表面，待菌液稍干燥后貼上16種含有抗生素的藥敏紙片，每個紙片之間的距離需要超過25 mm，每個平板上貼加4種紙片，將平板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，其后觀察并衡量藥敏紙片的抑菌圈大小，根據(jù)抑菌圈大小判定菌株對抗生素的敏感性。

2 結果

2.1 湘潭縣及周邊地區(qū)生豬Hps隱性感染情況調查

對120份生豬肺臟樣品處理后進行細菌分離，對菌株進行革蘭氏染色鑒定，最終發(fā)現(xiàn)27份樣品檢測為Hps陽性，平均陽性率為22.5%。此外，來源于湘潭縣、婁底市和長沙市生豬肺臟樣品數(shù)量分別為76份、29份和15份，陽性率分別為25.0%（19/76）、17.24%（5/29）和 20.0%（3/15）。

2.2 血清鑒定結果

使用多重PCR反應對本研究獲得的27株Hps菌株進行血清型鑒定，結果發(fā)現(xiàn)血清型有1型、4型、5型和不可分型菌株，其中血清4型最豐富，共分離出11株，所占比例為40.74%；血清5型和1型分離菌株分別為7株和5株，所占比例分別為25.92%和18.52%，而不可分型菌株所占比例最低，為 14.81%（4/27）。

2.3 藥敏試驗結果

對本研究獲得的菌株進行藥敏試驗，結果表明，27株分離株對不同種類抗生素的耐藥性存在較大差異，其中所有菌株對頭孢噻呋和諾氟沙星均敏感，對其他抗生素存在一定程度的耐藥性，其中對阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、阿米卡星、米諾環(huán)素、氯霉素和氟苯尼考存在較高的敏感性，敏感率分別為51.58%、92.59%、74.07%、66.67%、92.59%、96.27%和51.85%，對青霉素、卡那霉素和復方新諾明存在較高的耐藥性，耐藥率分別為81.48%、51.85%和92.59%。詳見表1。

表1 本研究分離的Hps菌株藥敏試驗結果 %

3 討論

副豬嗜血桿菌（Hps）在我國豬場廣泛流行，該病原感染健康豬群不易致病，常常以隱性感染形式存在，但對免疫力差的豬群可致病，嚴重時甚至導致死亡[1]。為初步了解湖南地區(qū)健康豬群Hps隱性感染情況及Hps對抗生素的耐藥情況，筆者從湘潭縣某屠宰場收集120份屠宰肥豬肺臟樣品，檢測Hps流行情況，結果發(fā)現(xiàn)當?shù)亟】捣守iHps平均隱性感染率為22.5%（27/120），其結果低于陜西地區(qū)（48.75%，39/80）[4]，但高于山東泰安等地區(qū)（2.14%，6/280）[9]，說明 Hps在我國不同地區(qū)健康豬群分布廣泛，隱性感染情況也存在較大差異。

進一步進行血清型鑒定，結果發(fā)現(xiàn)，湘潭縣及周邊地區(qū)健康豬群感染的Hps血清型較為復雜，其中血清4型最豐富，所占比例為40.74%，其次為血清5型和1型，所占比例分別為25.92%和18.52%，不可分型菌株所占比例為14.81%，其血清類型豐富度較河南省[10]低，這可能與樣品采集來源或菌株數(shù)量等差異有關。此外，不同菌株對抗生素耐藥性存在較大差異，但所有菌株對頭孢噻呋和諾氟沙星均敏感，大部分菌株對阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、阿米卡星、米諾環(huán)素、氯霉素和氟苯尼考存在較高的敏感性，提示以上抗生素是當?shù)刎i場預防Hps的首選藥物。