混合探針法評價天龍通心方對大鼠代謝酶活性的影響

苗蘭，林力，張穎，孫明謙，劉建勛，付建華

論著·實驗研究

混合探針法評價天龍通心方對大鼠代謝酶活性的影響

苗蘭，林力，張穎，孫明謙，劉建勛，付建華

中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091

為預防藥物相互作用導致的臨床合并用藥隱患，初步探討復方天龍通心方對大鼠體內藥物代謝酶的影響。實驗大鼠隨機分為空白對照組和天龍通心組，連續灌胃給藥14 d后再給予CYP1A2（咖啡因）、CYP2C6（氯沙坦）、CYP2C11（奧美拉唑）、CYP2D2（右美沙芬）和CYP3A1/2（咪達唑侖）混合探針藥，檢測給藥后不同時間點各探針藥及其特異代謝底物的血藥濃度，通過比較各探針藥與代謝物藥代動力學參數及代謝率（metablite/probe）變化，評價連續給予天龍通心方對大鼠體內CYP450代謝酶活性的影響。與空白對照組比較，連續給予大鼠天龍通心方后奧美拉唑峰濃度、體內暴露量均顯著下降，代謝率明顯升高，差異有統計學意義（＜0.05）；探針藥咖啡因達峰時間顯著推遲，代謝物和探針藥之比（ratio）下降30%，但差異無統計學意義（＞0.05）；咪噠唑侖及代謝產物1-羥基咪達唑侖達峰時間均延遲，而峰濃度、體內暴露水平均顯著下降，原型藥咪噠唑侖清除率顯著升高。其他各組探針底物及其代謝產物主要藥代動力學參數及代謝率差異均無統計學意義（＞0.05）。重復給予復方天龍通心方對大鼠體內CYP2C11（人體CYP2C19）可能存在一定的誘導作用，而對CYP1A2、CYP2C6、CYP2D2和CYP3A1/2無顯著影響，初步提示臨床應用天龍通心方時應避免與經CYP2C19代謝的藥物合并使用。

天龍通心方；CYP450；探針底物；LC-MS/MS；代謝活性；大鼠

天龍通心方由紅景天、紅參、丹參、川芎、龍血竭、冰片6味中藥組成，主要針對胸痹（冠心?。馓撗霾C特點而設，旨在發揮益氣活血、通絡止痛之功，臨床治療胸痛胸悶、心悸氣短、倦怠乏力之癥。前期藥效學研究表明，該藥可明顯減輕心肌梗死程度，縮小梗死面積，減輕梗死區質量，對心肌缺血所致心肌梗死有明確的保護作用，并具有抑制血小板聚集和血栓形成、降低血液黏度作用[1]。此外，針對天龍通心方還進行了體內外藥物化學成分的分析，體外定量18種主要成分，能完整描繪藥代曲線的入血成分有7種，分別是丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸、丹參素、紅景天苷、阿魏酸和迷迭香酸，為該藥藥效物質基礎提供一定依據[2]。

細胞色素P450酶（CYP450s）為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，其中CYP1、CYP2和CYP3亞家族主要負責人類和動物大量的內源性和外源性物質的Ⅰ相代謝[3-4]，包括藥物氧化、羥基化、去甲基化和氧化脫氨基等[5-6]。幾乎90%藥物都經體內CYP450s的代謝[7]，其中CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4亞型是負責人體內藥物代謝最重要的CYP亞家族，且各家族都具有高度的底物特異性，與人亞型相對應的大鼠CYP450s亞型分別是CYP1A2、CYP2C6、CYP2C11、CYP2D1/2和CYP3A1/2[4，8]。當體內CYP450s被強烈抑制或誘導時，將發生藥物相互作用，導致藥物血藥濃度改變，輕者藥物療效下降，重者產生毒副反應，甚至發生致命的相互作用。因此，明確治療藥物潛在的藥物相互作用具有重要的臨床和現實意義。本研究采用Cocktail探針藥物法，研究天龍通心提取物對大鼠體內5種CYP450s酶亞型CYP1A2、CYP2C6、CYP2C11、CYP2D2和CYP3A1/2的影響，獲取其代謝信息，為天龍通心方臨床合理應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠12只，體質量（220±20）g，購自斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，動物許可證號SCXK（京）2011-0004。所有動物均飼養于中國中醫科學院西苑醫院SPF級動物房，適應性飼養7 d，實驗前12 h禁食不禁水，實驗期間自由飲水，實驗12 h后進食。本實驗均符合北京實驗動物福利倫理審查指南的相關要求。

1.2 藥物與試劑

天龍通心提取物（每1 g浸膏粉相當于3.31 g原藥材，涿州東樂制藥有限公司，批號TL20140612）；咖啡因（caffeine，Sigma-Aldrich公司，批號112C5143），1,7-二甲基黃嘌呤（paraxanthine，Sigma- Aldrich公司，批號117K4122），去甲右美沙芬（dextrorphan，Sigma-Aldrich公司，批號057k4619），葡萄糖醛酸水解酶（Sigma-Aldrich公司，批號SLBC4010V），氯沙坦（losartan，中國食品藥品檢定研究院，批號100597-201102），奧美拉唑（omeprazole，批號100367-201003，中國食品藥品檢定研究院），右美沙芬（dextromethorphan，中國食品藥品檢定研究院，批號100201-201003），非那西?。╬henacetin，中國食品藥品檢定研究院，批號100095-198904），羰基氯沙坦（losartan carboxylic acid，TRC公司，批號1-BSR-34-8），5-羥基奧美拉唑（5-hydroxyomeprazole，TRC公司，批號1030-019A2），咪達唑侖（midazolam，IL公司，批號747335），1-羥基咪達唑侖（1-hydroxy midazolam，Cayman Chemical Company公司，批號0111），純度均大于98%。甲醇、乙腈均為色譜級（美國Fisher公司），甲酸為色譜級（J.T.Baker公司），水為蒸餾水（屈臣氏），其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

API 4000 QTRAP質譜系統（美國Applied Biosystem公司），Spark Holland Pico在線固相萃取系統，配有二元泵、溫控自動進樣器、SPE控制系統、溶劑傳輸單元和柱溫箱（荷蘭SPARK公司），Turbo Vap LV Evaporator樣品濃縮儀（美國Caliper Life Sciences公司），Shiseido MG Ⅲ（100 mm×2.0 mm，5 μm，日本Shiseido公司），0.2 μm過濾篩板（ESA公司），HySphere C18 HD Plate（10 mm×2 mm，7 μm，美國Waters公司），VX-02 Multi-Tube Vortex渦旋混合器（北京綠錦科技有限公司），MIKRO 22R低溫超速離心機（德國赫提馳Hettich公司），MSC-100 THERMO Shaker（Thermoelectric公司），AE240精密分析天平（美國Metter公司），HR-215S冰箱（青島海爾公司）。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

12只SD大鼠隨機分為空白對照組和天龍通心方組，每組6只。空白對照組予蒸餾水灌胃，天龍通心方組給予受試藥1 g/kg灌胃，給藥體積為10 mL/kg，連續14 d。實驗第15日，給予受試藥0.5 h后，再給予混合探針藥CYP1A2（咖啡因）8 mg/kg、CYP2C6（氯沙坦）5.2 mg/kg、CYP2C11（奧美拉唑）2 mg/kg、CYP2D2（右美沙芬）3 mg/kg和CYP3A1/2（咪達唑侖）0.7 mg/kg灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。

2.2 血漿樣品采集

給予混合探針藥后0.167、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h大鼠眼眶靜脈叢取血，每點取0.4 mL，4 ℃、3000 r/min離心10 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱凍存待測。

2.3 血漿樣品前處理

所有血漿樣品經β-葡萄糖醛酸水解酶處理后進行分析，將該酶溶解在0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中獲得2000 U/mL酶溶液。取血漿樣品放至室溫，分別精密吸取血漿樣品與酶溶液各100 μL混合，37 ℃振蕩孵育90 min，加400 μL含內標乙腈沉淀劑終止反應。劇烈振蕩2 min，12 000 r/min離心10 min，轉移480 μL上清液，50 ℃氮氣吹干。將殘余物復溶于15%有機相溶劑（甲醇∶乙腈∶水＝7.5∶7.5∶85）240 μL，渦旋，超聲，離心，取上清液，待分析。

2.4 色譜方法

2.4.1 online-SPE方法

采用由Symbiosis系統控制全自動固相萃取系統，使用HySphere-C18 HD（10 mm×2 mm，7 μm）SPE柱進行樣品萃取，在線固相萃取的步驟分為SPE柱裝載、洗滌和洗脫。具體步驟：96孔板中自動挑選所選SPE柱，將其置于左夾中，分別使用1 mL甲醇和0.01%甲酸水（V/V）進行調節和平衡；然后使用0.01%甲酸水0.7 mL作為上樣溶劑將樣品傳遞到萃取柱上，再經1.5 mL溶液洗滌；將柱子轉移到右夾，轉接至分析管路，使色譜流動相通過柱體，將分析物直接洗脫2 min到分析柱上。之后萃取柱經1.5 mL 0.01%甲酸水和2 mL甲醇分別清洗。萃取流程中除上樣時流速為0.8 mL/min外，其他過程的流速均為5 mL/min。

2.4.2 色譜分離條件

分析色譜柱是Shiseido MG Ⅲ（2.0×100 mm，5 μm），預柱采用0.2 μm過濾篩板，自動進樣器8 ℃，進樣量5 μL，柱溫40 ℃，運行時間5 min。流動相A為0.01%甲酸水溶液，流動相B為含0.01%甲酸的乙腈-甲醇混合液（1∶1，V/V），流速0.35 mL/min，洗脫程序：0→0.3 min，35%→72% B；0.3→2.3 min，72% B；2.3→2.5 min，72%→35% B。

2.5 質譜條件

質譜離子源為ESI源，氣簾氣體20 psi，源內溫度500 ℃，源內氣體GS1為50 psi，源內氣體GS2為40 psi，離子噴射電壓（IS）5000 V，碰撞氣（CAD）Medium，檢測方式正離子檢測，掃描方式選擇多反應監測（MRM）方式，用于定量分析的各離子對采用掃描時間為40 ms，EP為10 V，詳見表1。

表1 各成分離子對及質譜參數

分析物縮寫母離子（m/z）子離子（m/z）DP/VEP/VCE/VCXP/V CaffeineCAF195.2138.1761028.010.0 ParaxanthinePXT181.0124.0661029.08.0 OmeprazoleOMP346.3198.1481016.113.0 5-hydroxyomeprazoleHOMP362.0214.1531018.015.0 DextromethorphanDM272.3215.2501035.016.0 DextrorphanDP258.1157.11481056.010.6 MidazolamMDZ326.1291.2801038.520.0 1-hydroxymidazolamHMDZ342.1324.1771031.09.0 LosartanLK437.2207.2651032.015.0 Losartan carboxylic acidE3174423.2207.2601033.015.0 IS-PhenacetinPNT180.1110.0701030.57.0

3 數據處理及分析

研究中待測成分藥代動力學參數計算采用非房室模型統計距法，應用末端消除半衰期（1/2）、峰濃度（max）、達峰時間（max）、0到最后可觀測時間點的曲線下面積（0-t），以生物利用度矯正的藥物消除相表觀分布容積（z/）、總清除率（CL/F）表征各探針藥的藥代動力學性質，以max、max和0-t描述特異代謝產物的藥動學行為，以代謝物與探針的0→t之比（ratio）來反映對應代謝酶的代謝活性。采用SPSS18.0統計軟件進行分析，組間比較用非成對檢驗。＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 底物探針及其代謝物的分析方法學

經對樣本前處理方法、液相條件和質譜參數的優化，最終建立大鼠血漿中5種探針藥及其代謝物在線SPE-LC-MS/MS分析方法，并對所建立的分析方法進行特異性、線性、基質效應、精密度、準確度及穩定性的考察和驗證，結果表明所建立分析方法符合生物分析方法學要求[9]。根據化合物質譜特征和體內濃度范圍，確定10個成分線性范圍，見表2。

4.2 天龍通心方對大鼠CYP1A2代謝酶的影響

CYP1A2主要表達于肝臟，約占肝CYP總含量15%[4]，在多種物種間表現出高度保守性，而咖啡因是人和大鼠CYP1A2特異性底物[10]。用藥前后探針藥咖啡因（CAF）及其代謝物1,7-二甲基黃嘌呤（PXT）藥時曲線見圖1，藥代參數見表3、表4。實驗結果顯示，天龍通心方連續給藥14 d，與空白對照組比較，探針藥CAF峰濃度有所下降，峰面積無顯著變化，差異無統計學意義（＞0.05），而達峰時間顯著推遲，差異有統計學意義（＜0.05），代謝物PXT峰面積較空白對照組有所降低，但差異無統計學意義（＞0.05）；作為代謝率指標的代謝物和探針藥之比（ratio）無顯著變化，表明天龍通心方對大鼠CYP1A2酶活性無顯著影響。

表2 探針藥及其代謝物標準曲線和線性范圍

分析物回歸方程相關系數 線性范圍/（ng/mL） CAFY＝0.004 31X＋0.1860.990 161.44～15 000 PXTY＝0.004 52X＋2.9×10-20.993 510.24～2500 LKY＝0.093 5X－8.66×10-30.996 3 4.10～1000 E3174Y＝0.043 9X＋7.5×10-20.995 0 8.19～2000 OMPY＝0.092X＋5.47×10-20.993 2 2.05～500 HOMPY＝0.026 7X＋2.12×10-30.999 95 1.23～300 DMY＝0.019X＋3.46×10-30.992 9 0.41～100 DPY＝0.006 99X＋6.54×10-30.992 0 4.10～1000 MDZY＝0.031 3X＋1.21×10-30.993 5 0.10～25 HMDZY＝0.039 3X－3.43×10-30.999 6 0.64～25

圖1 2組大鼠CAF及其代謝物PXT平均血漿藥時曲線比較（n＝6）

表3 2組大鼠探針底物CAF藥代動力學指標比較（±s，n＝6）

注：與空白對照組比較，*＜0.05，**＜0.01（下同）

表4 2組大鼠探針底物CAF代謝物PXT藥代動力學指標比較（±s，n＝6）

4.3 天龍通心方對大鼠CYP2C酶活性的影響

CYP2C亞家族是含量最為豐富的亞家族，占人類CYP肝藥酶總量的20%以上，其中CYP2C9和CYP2C19是2個最活躍的成員，負責大多數內源性和外源性化合物的代謝[11]。大鼠CYP2C6和CYP2C11是人CYP2C9和CYP2C19的同源蛋白，具有一定的對應性[12-14]。用藥前后探針藥氯沙坦（LK）及其代謝物E3174藥時曲線見圖2，藥代參數結果見表5、表6。連續給予大鼠天龍通心方后，探針藥LK及其代謝物E3174的藥代參數與空白對照組比較均無顯著改變，且代謝率ratio也無變化，結果提示重復給予天龍通心方不會對大鼠CYP2C6的活性產生影響。用藥前后探針藥奧美拉唑（OMP）及其代謝物5-羥基奧美拉唑（HOMP）藥時曲線見圖3，藥代參數結果見表7、表8。與空白對照組比較，連續給藥后原型藥OMP峰濃度、體內暴露量顯著下降（＜0.05），代謝物HOMP藥代參數無顯著改變，代謝率ratio明顯升高（＜0.05），表明連續予天龍通心方可能對大鼠CYP2C11有一定誘導作用。

圖2 2組大鼠LK及其代謝物E3174平均血漿藥時曲線比較（n＝6）

表5 2組大鼠探針底物LK藥代動力學指標比較（±s，n＝6）

表6 2組大鼠探針底物LK代謝物E3174藥代動力學指標比較（±s，n＝6）

圖3 2組大鼠OMP及其代謝物HOMP平均血漿藥時曲線比較（n＝6）

表7 2組大鼠探針底物OMP藥代動力學指標比較（±s，n＝6）

表8 2組大鼠探針底物OMP代謝物HOMP藥代動力指標比較（±s，n＝6）

4.4 天龍通心方對大鼠CYP2D2代謝酶的影響

CYP2D6在人肝臟中表達較低，但30%藥物的生物轉化都與該酶有關[15]。人體內CYP2D6特異性介導右美沙芬（DM）代謝成去甲右美沙芬（DP）這一過程在大鼠體內由肝臟CYP2D2介導[16]。探針藥DM及其代謝物DP藥時曲線見圖4，藥代參數結果見表9、表10。與空白對照組比較，天龍通心方對DM及其代謝物藥代參數均無影響，盡管ratio明顯上升（39%），但由于個體差異較大并無統計學意義，表明重復給予天龍通心方不會引起CYP2D2活性改變。

4.5 天龍通心方對大鼠CYP3A1/2代謝酶的影響

CYP3A亞家族參與50%以上治療藥物生物轉化[15]，其中CYP3A4是最豐富和最重要的亞型。咪噠唑侖（MDZ）是人CYP3A4特異性探針底物，雄性大鼠中MDZ代謝主要由CYP3A1/2介導[16]。探針藥MDZ及其代謝物藥時曲線見圖5，藥代參數結果見表11、表12。與空白對照組比較，MDZ及代謝產物HMDZ峰濃度和體內暴露水平均顯著下降，而代謝率無顯著變化，表明重復給藥后天龍通心方不會對MDZ代謝產生影響。體內暴露水平的降低可能是由于天龍通心方影響MDZ的吸收所致。

圖4 2組大鼠DM及其代謝物DP平均血漿藥時曲線比較（n＝6）

表9 2組大鼠探針底物DM藥代動力學參數比較（±s，n＝6）

表10 2組大鼠探針底物DM代謝物DP藥代動力學參數比較（±s，n＝6）

圖5 2組大鼠MDZ及其代謝物HMDZ平均血漿藥時曲線比較（n＝6）

表11 2組大鼠探針底物MDZ藥代動力學參數比較（±s，n＝6）

表12 2組大鼠探針底物MDZ代謝物HMDZ藥代動力學參數比較（±s，n＝6）

5 討論

許多研究顯示，中藥對P450系統具有顯著影響。馬增春等[17]發現四物湯對大鼠CYP2B6酶活性具有抑制作用，對CYP1A2具有誘導作用。尚芳紅等[18]發現加味佛手散膠囊對大鼠和人肝微粒體CYP2D、CYP2E1、CYP3A酶活性可能有體外抑制作用。Zhang等[9，12]發現塞絡通單次給藥和連續給藥對大鼠代謝酶影響存在差異，表明藥物成分對肝藥酶影響具有累積效應。還有報道顯示，丹紅注射液對人肝微粒體CYP2A6具有很強的抑制作用，對CYP1A2、CYP2B6、CYP2B8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4具有中等強度抑制作用，同時顯示對大鼠及人原代肝細胞CYP3A4具有誘導作用[19-20]。Qiu等[21-22]發現，單劑量丹參提取物可抑制健康受試者腸道CYP3A，多劑量可誘導腸道和肝臟CYP3A。綜上，中藥復方對藥物代謝酶活性存在抑制或誘導，甚至雙向作用，在合并用藥時可能引起藥物間相互作用。

Cocktail探針藥物法是Breimer于1990年提出的[23]，該方法能在同一動物上同時獲取多個CYP450同工酶表型信息，減小個體差異對數據波動性影響，是進行藥物研發的有效手段。本研究同時考察大鼠血漿中5種探針藥物及其代謝物濃度，通過特異性探針藥物代謝消除率判定藥物對酶活性的影響。本實驗動物采樣周期12 h，盡管E3174和DP濃度較高，但此時血藥濃度已回落，前期研究這2個成分后續無再次達峰現象，并且天龍通心方并未對LK和DM的代謝物藥代參數有顯著影響。所以，雖然E3174和DP未獲得完整的藥時曲線，但不影響實驗結果。實驗結果表明，連續給予大鼠天龍通心提取物對大鼠肝藥酶CYP1A2、CYP2C6、CYP2D2和CYP3A1/2未表現出明顯抑制或誘導作用，但對CYP2C11（人體CYP2C19）存在一定誘導作用（＜0.05），提示臨床上與經CYP2C19代謝的藥物聯用可能出現藥物相互作用。如與經CYP2C19代謝的奧美拉唑合并用藥時，可能加快該藥代謝，降低血藥濃度，從而降低藥效。若與經CYP2C19代謝產生活性代謝物而起治療作用的抗血小板藥氯吡格雷同時應用，導致血中活性代謝物水平升高，從而可能增加藥物產生不良反應的風險[24]。

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Evaluation of Effects ofPrescription on Metabolic Enzymes by Mixed Probe in Rats

MIAO Lan, LIN Li, ZHANG Ying, SUN Mingqian, LIU Jianxun, FU Jianhua

To prevent potential clinical complications caused by medicine interaction through preliminarily investigating the effects ofPrescription on metabolic enzymes in rats.The experiment rats was randomly divided into blank group andg roup. After pretreatment for 14 days withPrescription, these rats were given mixed probe drugs of CYP1A2 (caffeine), CYP2C11 (omeprazole), CYP2C6 (losartan), CYP2D2 (dextromethorphan) and CYP3A1/2 (midazolam). The blood concentration of each probe drug and its specific metabolic substrate at different time points after administration were detected. The effects ofPrescription on CYP450 metabolic enzyme activity in rats were evaluated by comparing the plasma pharmacokinetic parameters and metabolic rate (metablite/probe) changes of each probe drug and metabolite.Compared with blank group, the peak concentration and systematic exposure of omeprazole decreased significantly and the metabolic rate increased significantly after continuous administration ofPrescription, with statistical significance (<0.05). At the same time, the peak time of probe drug caffeine was significantly delayed, and theratioof metabolites and probe drug decreased by 30%, without statistical significance (>0.05). However, the peak time of midazolam and the metabolite 1-hydroxymidazolam were delayed, while the peak concentration and exposure levels in the body decreased significantly, and the clearance rate of the prototype drug midazolam increased significantly. The main pharmacokinetic parameters and metabolic rates of probe substrates and their metabolites in other groups were not significantly different.Repeated administration ofPrescription may induce CYP2C11 in rats (CYP2C19 in human), but has no significant effect on CYP1A2,CYP2C6, CYP2D2 and CYP3A1/2. It is preliminarily suggested that the combination with drugs metabolized by CYP2C19 should be avoided in clinical application ofPrescription.

Prescription; CYP450 enzymes; substrates of probe; LC-MS/MS; metabolites; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)09-0051-07

10.3969/j.issn.1005-5304.202003217

國家自然科學基金（81774145、81803770）；國家科技重大專項－重大新藥創制（2012ZX09103201-049）

付建華，E-mail：jianhuaffcn@263. net

（2020-03-09）

（2020-03-23；編輯：華強）