基于支持向量機模型的中藥揮發油化學成分類型與皮膚細胞毒性關聯性研究

楊文國，喬兆穎，戴沭寧，張沁晶，朱學敏，姚俊宏，陳軍

基于支持向量機模型的中藥揮發油化學成分類型與皮膚細胞毒性關聯性研究

楊文國1，喬兆穎2，戴沭寧2，張沁晶2，朱學敏3，姚俊宏3，陳軍3，4

1.南京中醫藥大學人工智能與信息技術學院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學衛生經濟管理學院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；4.南京中醫藥大學江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023

探尋中藥揮發油的化學成分類型與皮膚細胞毒性之間的關聯性，并建立皮膚細胞毒性預測模型。應用位于活性表皮的人角質形成細胞HaCaT評價皮膚毒性，并通過氣相色譜-質譜分析得到揮發油的化學成分分類。運用非參數統計和支持向聯機選取特征變量并建立預測模型。不同毒性程度中藥揮發油的單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物和單萜與芳香族復合結構與中藥揮發油皮膚細胞毒性存在顯著關聯（＜0.05）。基于上述4種化學成分進行特征構造，利用支持向量機建立的皮膚細胞毒性預測模型具有良好的預測性能。支持向量機模型可用于闡明中藥揮發油化學成分類型與皮膚細胞的關聯性。

中藥揮發油；皮膚細胞毒性；非參數統計；支持向量機

經皮給藥是中藥除口服外的常用給藥途徑，具有給藥方便、血藥濃度平穩、避免首過效應和胃腸道不良反應、可隨時中止用藥等諸多優勢。但由于皮膚角質層的屏障作用，經皮給藥生物利用度偏低，嚴重限制了藥效的發揮。透皮吸收促進劑（penetration enhancers，PE）是目前最常用的解決這一問題的制劑學手段[1]，而中藥揮發油是常用的一大類PE[2]，具有促滲作用好、毒性低、藥效協同的特點。

除促滲作用外，PE皮膚毒性是決定其應用前景的主要因素。與常規的化學合成PE相比，皮膚毒性相對較低是中藥揮發油的主要優勢。前期研究表明，中藥揮發油的皮膚細胞毒性遠低于以氮酮為代表的化學合成PE[3]。因此，本研究選擇經典的、位于活性表皮層的人角質形成細胞HaCaT作為模型，考察33種辛味中藥揮發油的皮膚細胞毒性，并借助數據挖掘和數學建模手段分析中藥揮發油化學成分類型與皮膚細胞毒性的關聯性。

1 儀器、試藥與細胞

調溫電熱器（南通市通州申通電熱器廠），揮發油提取器，WAY-2S型阿貝折光儀（上海精密科學儀器有限公司），BAS-124S型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司），INCO108型CO2培養箱（德國Memmert公司），XD-202型倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司），SW-CJ-IF型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），Spectramax M5型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司），96孔細胞培養板（康寧公司），DW-86L338型-80 ℃冰箱（海爾生物醫療），血細胞計數板（上海求精生化試劑儀器有限公司），EPED-10TF型實驗室超純水器（南京易普易達科技發展有限公司）。

中藥飲片干姜、高良姜、小茴香、蛇床子、廣藿香、莪術、蓽澄茄、羌活、細辛、草果、香附、川芎、荊芥、石菖蒲、丁香、當歸、花椒、吳茱萸（批號分別為20150301、20140701、150401、150601、20141201、20140701、20150416、20150506、20150801、20150412、20141201、20140801、20150618、150601、20141201、20150308、150106、150212），安徽銅陵中藥飲片有限公司；陳皮、檀香、青皮、沒藥、豆蔻、辛夷、烏藥、草果（批號分別為170101、160927、161216、161209、161109、161206、161130、161016），蘇州市天靈中藥飲片有限公司；楓香脂（批號170119），南京海源中藥飲片有限公司；肉桂（批號150121），亳州市永剛飲片有限公司；藁本（批號161018012），江西濟世堂藥業有限公司；香薷（批號111126006），北京仟草中藥飲片有限公司；紫蘇葉（批號151201），東營百佳益中藥飲片有限公司。松節油（批號20140924），永華化學科技（江蘇）有限公司；薄荷油（批號150326），黃山天目薄荷藥業有限公司。胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號150624），0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（上海立菲生物技術有限公司，批號1828698），青霉素-鏈霉素溶液（碧云天生物技術有限公司，批號C0222），MTT細胞毒性試劑盒（上海生工生物工程有限公司，批號150614），二甲基亞砜（DMSO，江蘇凱基生物股份有限公司，批號130815），無水硫酸鈉（南京化學試劑有限公司，批號150302367D），超純水（實驗室自制），其他試劑均為分析純。

人永生化角質形成細胞HaCaT，購自江蘇凱基生物股份有限公司，以DMEM（高糖）培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液）培養于37 ℃、5%CO2培養箱。

2 方法與結果

2.1 揮發油制備及氣相色譜-質譜分析

除松節油和薄荷油外，采用水蒸氣蒸餾法提取其余31種中藥揮發油[3-4]。

2.2 揮發油對HaCaT細胞毒性評價

取對數生長期的HaCaT細胞，制成單個細胞懸液，調整細胞濃度，以7×103個/孔接種于96孔培養板，37 ℃、5%CO2培養過夜，分別加入不同濃度揮發油溶液，每個濃度設5個復孔。以不加PE溶液的細胞懸液作為陰性對照組，并以不含細胞的培養基作為空白組調零。處理24 h后，每孔加入含0.5 mg/mL MTT的不含胎牛血清培養基120 μL，培養4 h，吸棄上清，每孔加DMSO 150 μL，搖床10 min搖勻，于酶標儀570 nm波長處測定吸光度，計算存活率和IC50。存活率（%）＝（A揮發油組－A空白組）÷（A陰性對照組－A空白組）×100%。根據IC50將揮發油毒性分為小、中、大3類，結果見表1。

2.3 揮發油化學成分毒性非參數統計

以Y代表毒性，X1～X12依次代表單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜化合物、倍半萜氧化物、二萜及其氧化物、脂肪族及脂肪酸類成分、芳香族成分、單萜與芳香族復合結構、倍半萜與芳香族復合結構、單萜氧化物與芳香族復合結構、苯酞類成分和其他。利用SPSS22.0統計軟件對X1～X12進行分析，根據偏態系數發現數據均呈右偏分布。單樣本Kolmogorov- Smirnov擬合優度檢驗適合在分布未知和樣本量比較小的條件下分析樣本分布與正態分布間是否存在顯著差異，從而判定變量是否服從正態分布。檢驗結果顯示，值均小于0.05，可知X1～X12均不服從正態分布。由于樣本數據均不服從正態分布且根據毒性分類后每類樣品數據較少，故采用非參數統計的Kruskal-Wallis檢驗進行分析，結果表明單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物、單萜與芳香族復合結構的含量與揮發油的毒性強度具有關聯性，見表2。

表1 33種中藥揮發油的皮膚細胞毒性

中藥IC50/（μg/mL）毒性主要化學成分 荊芥304.27小單萜氧化物90.95%、單萜化合物3.74%、脂肪族及脂肪酸類成分3.36% 花椒333.69小單萜化合物30.44%、單萜氧化物51.18%、脂肪族及脂肪酸類成分15.98% 小茴香332.78小芳香族成分91.89%、單萜化合物5.34%、單萜氧化物1.55% 豆蔻123.10小單萜氧化物74%、單萜化合物18.85%、倍半萜化合物3.96% 細辛161.80小芳香族成分48.68%、單萜與芳香族復合結構26.71%、單萜化合物17.02%、單萜氧化物7.73% 丁香192.25小芳香族成分97.67%、倍半萜化合物1.79% 藁本138.10小芳香族成分90.53%、單萜化合物4.61%、單萜氧化物3.16% 薄荷油97.01小單萜氧化物75.76%、單萜化合物4.61%、脂肪族及脂肪酸類成分0.3% 石菖蒲65.42中芳香族成分59.36%、倍半萜氧化物23.74%、倍半萜與芳香族復合結構3.58% 陳皮49.74中單萜化合物96.78%、倍半萜化合物1.88% 草果68.75中單萜氧化物52.07%、脂肪族及脂肪酸類成分14.81%、芳香族成分11.36%、單萜化合物7.32% 蓽澄茄69.89中單萜化合物51.43%、單萜氧化物33.63、倍半萜氧化物4.07% 楓香脂39.77中單萜氧化物46.36%、倍半萜化合物23.47%、單萜化合物18.77% 香薷50.58中芳香族成分41.74%、單萜氧化物17.66%、倍半萜化合物15.46%、單萜氧化物與芳香族復合結構13.93% 青皮37.74中單萜化合物62.38%、倍半萜化合物14.59%、單萜與芳香族化合結構13.34% 莪術39.63中倍半萜氧化物71.34%、芳香族成分10.07%、倍半萜化合物6.65% 辛夷31.66中單萜氧化物34.04%、倍半萜化合物27.67%、單萜化合物22.29% 吳茱萸49.22中單萜化合物71.99%、單萜氧化物9.9%、倍半萜化合物7.28%、倍半萜氧化物4.88% 川芎30.21中苯酞類成分48.4%、芳香族成分13.79%、單萜氧化物11.99%、倍半萜化合物10.19%、單萜化合物7.57% 沒藥28.13中倍半萜化合物36.14%、單萜化合物15.25%、芳香族成分12.54%、倍半萜氧化物8.87% 當歸34.44中苯酞類成分83.86%、單萜化合物7.55%、芳香族成分2.54%、倍半萜化合物1.45% 松節油32.55中單萜化合物58.37%、單萜氧化物36.46%、單萜與芳香族復合結構3.81% 高良姜42.75中單萜氧化物60.88%、倍半萜化合物18.73%、單萜化合物9.63% 蛇床子29.92中單萜化合物84.45%、單萜氧化物9.86%、倍半萜化合物1.42% 烏藥22.29中芳香族成分45.9%、倍半萜化合物24.98%、倍半萜氧化物6.89%、單萜化合物6.68% 羌活24.64中單萜化合物85.03%、單萜與芳香族復合結構6.45%、單萜氧化物4.37% 檀香16.57大倍半萜氧化物84.46%、芳香族成分4.02% 紫蘇葉23.26大芳香族成分86.54%、倍半萜化合物7.13%、倍半萜氧化物4.51% 廣藿香14.15大倍半萜氧化物55.84%、倍半萜化合物41.9% 干姜19.72大倍半萜化合物59.76%、倍半萜與芳香族復合結構8.97%、單萜化合物14.07% 香附14.40大倍半萜氧化物50.59%、倍半萜化合物31.81%、芳香族成分7.53% 白芷11.32大脂肪族及脂肪酸類成分64.59%、倍半萜化合物23.96%、倍半萜氧化物5.12% 肉桂12.47大芳香族成分63.39%、倍半萜化合物33.75%

2.4 利用支持向量機進行毒性強度預測

支持向量機（support vector machine，SVM）是一種針對小樣本問題而提出的機器學習方法，可以在樣本有限的情況下獲得最優解。SVM利用非線性變換將原始變量映射到高維特征空間，在其中構造線性分類函數，既保證了模型具有良好的泛化能力，又解決了“維數災難”的問題，可用來解決分類、模式識別、回歸、擬合等問題。本研究采用Libsvm工具箱，調用相關的SVM模式識別與回歸機軟件包，進行相應的回歸與預測。根據非參數檢驗得知，不同毒性的揮發油中X1、X2、X4、X8含量顯著不同。利用SVM算法，根據X1、X2、X4、X8含量對揮發油的毒性強度（大、中、小）進行預測，建立中藥揮發油分類模型，并對性能進行評價。以隨機產生29個樣本為訓練集，4個樣本為測試集，創建并訓練SVM模型，采用RBF核函數。首先利用交叉驗證方法尋找最佳的參數c（懲罰因子）和參數g（RBF核函數中的方差），然后利用最佳參數對模型進行訓練。MATLAB訓練結果見圖1。

結果顯示測試集的準確率為100%，表明可通過SVM算法，根據中藥揮發油的單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物、單萜與芳香族化合結構的含量，對揮發油的毒性類別（小、中、大）進行預測，預測準確程度良好，具有現實操作性。

表2 不同類型揮發油化學成分毒性Kruskal-Wallis檢驗結果

變量化學成分類型毒性強度*秩平均值P值 X1單萜化合物118.75 219.610.026 3 8.29 X2單萜氧化物123.50 216.920.023 3 9.79 X3倍半萜化合物110.50 219.110.092 319.00 X4倍半萜氧化物1 7.38 218.940.003 323.00 X5二萜及其氧化物116.00 216.890.459 318.43 X6脂肪族及脂肪酸類成分116.25 215.920.509 320.64 X7芳香族成分116.06 216.690.837 318.86 X8單萜與芳香族復合結構119.00 218.720.046 310.29 X9倍半萜與芳香族復合結構113.50 217.280.160 320.29 X10單萜氧化物與芳香族復合結構117.13 217.720.536 315.00 X11苯酞類成分117.13 217.720.651 315.00 X12其他115.00 216.830.247 319.71

注：*1、2、3分別表示揮發油毒性小、中、大

圖1 測試集SVM函數結果對比

2.5 利用支持向量回歸機進行回歸預測

實際中需要對中藥揮發油的毒性進行更加精確的預測，故采用支持向量回歸機方法對毒性的具體數值進行預測。模型采用RBF核函數，然后利用交叉驗證方法尋找最佳的參數c和參數g，并利用最佳參數訓練模型。為避免偶然性，將33個樣本分為10組，其中7組樣本容量為3，另3組樣本容量為4，每組輪流做測試集，進行10次測試，結果見表3。訓練集R2平均值為0.715，MSE平均值為0.095，擬合程度良好。預測集R2平均值為0.727，MSE平均值為0.099，預測性能良好。因此，利用SVM算法對中藥揮發油的毒性進行回歸預測是可行且效果優秀的，模型仍有改進空間，但總體模型與真實值已高度接近。

表3 支持向量回歸機測試結果

序號訓練集 測試集 R2MSE R2MSE 10.7270.089 0.6030.201 20.6940.103 0.8750.102 30.6640.113 0.7400.095 40.6180.124 0.5740.105 50.6640.118 0.5820.113 60.6530.127 0.9080.014 70.6880.108 0.6720.071 80.6590.124 0.7120.177 90.9020.029 0.7320.084 100.9270.014 0.8730.032 平均值0.7150.095 0.7270.099

3 討論

對經皮給藥而言，大部分藥物因不易透過皮膚而導致生物利用度過低甚至無法發揮藥效。應用PE是目前解決這一問題的最主要手段，而中藥揮發油為常用PE。中藥揮發油總數約有300種，目前作為PE應用的僅34種[5]。如何從中藥揮發油中遴選安全有效的PE是目前研究的難點。

除透皮吸收促進效果外，安全性是決定PE應用的另一主要因素，皮膚細胞毒性評價是預測PE安全性的一個重要因素。中藥揮發油類成分以萜類成分為主，根據文獻[6]可分為12類。本研究在皮膚細胞毒性評價的基礎上，應用數學模型，深入探討中藥揮發油皮膚細胞毒性與其物質基礎即成分類型之間的相關性，結果發現單萜化合物、單萜氧化物、倍半萜氧化物等成分類型與皮膚細胞毒性的相關性最高，初步闡明了中藥揮發油毒性作用的物質基礎，對于開發高效低毒的中藥揮發油PE具有重要意義。

[1] 楊華生,朱慶文,梁秉文.藥用輔料在中藥經皮給藥制劑中的應用[J].中醫外治,2007,16(3)：3-5.

[2] 陳軍,劉培,蔣秋冬,等.中藥揮發油作為透皮吸收促進劑的現狀與展望[J].中草藥,2014,45(24)：3651-3655.

[3] 楊文國,姚俊宏,陳軍,等.33種辛味中藥揮發油皮膚細胞毒性與藥性特征的關聯性研究[J].南京中醫藥大學學報,2017,33(6)：597-602.

[4] 蔣秋冬,楊文國,蔡皓,等.透皮促滲中藥揮發油的化學成分與中藥藥性關聯性研究[J].中國中藥雜志,2016,41(13)：2500-2505.

[5] 楊文國,陳軍,劉培,等.基于數據挖掘方法研究揮發油透皮促滲作用與中藥藥性間的關聯性[J].中國中藥雜志,2015,40(23)：4609-4615.

[6] 覃潔萍,劉進,陳玉萍,等.解表類中藥揮發性成分與藥性的相關性研究[J].計算機與應用化學,2013,30(1)：85-88.

Study on Correlation Between Chemical Components and Cytotoxicity of TCM Essential Oils Based on SVM

YANG Wenguo1, QIAO Zhaoying2, DAI Shuning2, ZHANG Qinjing2, ZHU Xuemin3, YAO Junhong3, CHEN Jun3,4

To explore the correlation between chemical components and skin cytotoxicity of TCM essential oils; To establish a skin prediction model.The cytotoxicity was evaluated by HaCaT cells located in the active epidermis. The chemical components of TCM essential oils was investigated by GC-MS analysis. The non-parametric statistics was used for feature selection and support vector machine (SVM) was used to establish the prediction model.Monoterpenes, oxygenated monoterpenes, oxygenated sesquiterpene and the combined structure of monoterpene and aromatic had significant correlation with the cytotoxicity (<0.05). Based on the above four chemical components for feature construction, the established skin cytotoxicity prediction model using SVM had good prediction performance. Conclusion SVM can be used to clarify the correlation between chemical components and cytotoxicity of TCM essential oils.

TCM essential oils; skin cytotoxicity; non-parametric statistics; support vector machine

R285.5；R2-05

A

1005-5304(2020)09-0121-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201812016

江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心重點項目（ZDXMHT-1-15）；江蘇省中醫藥局科研專項（ZX2016D1）；江蘇省大學生創新訓練計劃重點項目（201810315027Z）；江蘇省高校優勢學科建設工程（2014年）；南京中醫藥大學中藥學優勢學科專項培育基金（2017年）

陳軍，E-mail：chenjun75@163.com

（2018-12-02）

（2019-01-28；編輯：陳靜）