利用高通量靶向基因編輯可加速玉米功能基因挖掘

近日，華中農業大學嚴建兵教授及國內外多家合作單位的研究成果以“High throughput CRISPR/Cas9 mutagenesis streamlines trait gene identification in maize”為題在The Plant Cell期刊發表，研究提出構建基于先驗知識的靶向突變體庫（knowledge-driven targeted mutagenesis），可以大大加速功能基因的挖掘。

挖掘影響重要性狀的基因是作物遺傳改良的關鍵路徑之一。然而，當前基因克隆的方法大多費時費力、效率較低，難以滿足全球日益增長的對糧食總量及營養品質提升的需求。當前挖掘功能基因主要有兩種方法：一是構建各種群體通過連鎖或關聯分析進行遺傳定位，二是借助隨機突變體庫通過對表型的大規模篩選進而鑒定功能基因。遺傳定位十分耗時耗力，即便被寄予厚望的關聯分析也很難達到預期單基因水平的精度，依舊需要發展新的群體進行精細定位，且發展的特定群體一般僅能針對特定性狀的特定QTL（Quantitative Trait Locus）。基于生物、化學乃至物理技術所構建的突變體庫已被廣泛用于作物基因挖掘，然而這一方法常常需要群體大面積種植后進行目標表型篩選，而缺少針對性，即便篩選到目標表型由于單個突變植株往往攜帶數十個乃至上百個突變位點，依舊需要進一步發展群體進行功能基因篩選及驗證。這些不足造成當前基因克隆整體效率較低，無法通量化，成本較高。

近年來CRISPR/Cas9系統由于靶向性及特異性非常高、操作簡單快捷等優勢已被廣泛用于各種物種的基因編輯，并已在水稻和大豆中實現了大規模的突變體資源的創制。但這些大規模基因編輯的研究主要將CRISPR/Cas9作為傳統突變手段的替代品，如何針對植物特性完善從靶標設計到突變序列檢測全流程的高通量體系、降低成本、挖掘這一新興技術應用后對基因組影響的規律等缺乏深入研究。特別是由于玉米基因組龐大復雜、可穩定轉化的品系有限、轉化效率較低等問題，以玉米為代表探索建立相應體系更具挑戰性，也更具廣泛借鑒性。

本研究中作者提出了綜合傳統遺傳定位和高通量靶向基因編輯加速玉米功能基因挖掘的思路，這一設想在于充分利用CRISPR/Cas9高度特異和靶向性的同時，借助先前的定位線索為每一個靶向基因提供預期的潛在表型。該研究包括三方面亮點。

一是探索并完善了基于CRISPR/Cas9的高通量的技術體系，大大降低了成本。例如，課題組前期完成了適用于非參考基因組高通量設計sgRNA的流程;完成了覆蓋目標基因所需轉化事件的設計和模擬分析;通過改進MassARRAY和靶向捕獲測序技術實現高通量和低成本的靶標突變序列鑒定。

二是基于先驗知識的靶向突變體庫是玉米功能基因挖掘的有益資源。研究人員利用近期CUBIC群體所獲大量初定位QTL及其他重要候選基因，進行了1000多個候選基因的大規模實驗。通過調查QTL區間所有基因突變體的表型就可以鑒定到功能基因，省去了繁雜的精細定位過程。研究人員不僅利用所獲靶向突變體庫對遺傳定位的共驗證，還分析了同一QTL鑒定到多個功能基因、更豐富的非預期突變表型的獲得、基因冗余導致編輯后未有預期表型等多個案例，揭示了傳統基因定位克隆手段難以發現的科學現象和規律，展現了這一靶向突變體庫的重要價值。

三是增加了對植物基因編輯規律的認識。本研究發現植物基因編輯突變譜與人類細胞系一樣，且具有較高的可預測性。目標基因的表達模式對編輯產物有顯著影響。此外，該研究還發現一定頻率的以體內異源（不同染色體）模板進行同源重組介導的基因修復（homology-directed repair）現象，為基因敲入提供了新的思路。研究人員指出作物基因編輯過程中的脫靶頻率很低，但嵌合現象以及由于基因冗余帶來的額外靶點的存在值得高度重視。

同期的The Plant Cell雜志以“作物大規模基因組編輯的路線圖（A Roadmap Toward Large-Scale Genome Editing in Crops）”為題配發評論，認為作者漂亮地展示了如何利用新的工具來進行基因發現和驗證，總結了多個應用場景，并稱該方法為“暴力破解方法（Brute-force approaches）”。

（來源：華中農業大學網站）