滋陰熄暈丸提取工藝研究*

張 瑋，李海松

(河南省中研醫(yī)藥科技有限公司，河南 鄭州 450004)

滋陰熄暈丸為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由熟地黃、酒萸肉、山藥、赤芍、茯苓、牡丹皮、澤瀉、菊花、天麻、枸杞子、鉤藤十一味中藥組成，具有滋腎養(yǎng)肝、息暈止眩的功效，可用于肝腎陰虛所致眩暈、頭痛、視物昏花、雙目干澀、腰膝酸軟、失眠多夢、心煩口干等的治療，擬將其開發(fā)成醫(yī)院制劑投入臨床應(yīng)用。根據(jù)方中藥物的有效成分理化性質(zhì)，采取部分藥材提取精制，部分藥材粉碎后直接入藥。方中酒萸肉中含有馬錢苷等苷類成分[1-2]，赤芍中含有皂苷類成分[3]，具有較好的水溶性，可采用加水煎煮提取。據(jù)報(bào)道，山茱萸中馬錢苷等環(huán)烯醚萜苷類成分[4-5]具有抑制神經(jīng)退行性病變(抑制Ca2+失衡、抗氧化應(yīng)激的損傷、神經(jīng)保護(hù)作用、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎)、抗血栓等作用[6]，芍藥苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用[7]?！吨袊幍洹?015版一部山茱萸和赤芍藥材分別測定了馬錢苷和芍藥苷的含量，在實(shí)驗(yàn)中采用正交實(shí)驗(yàn)法，選取酒萸肉中的馬錢苷、赤芍中的芍藥苷作為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選提取工藝。

1 藥品、試劑與儀器

滋陰熄暈丸處方組成：熟地黃、酒萸肉、山藥、赤芍、茯苓、牡丹皮、澤瀉、菊花、天麻、枸杞子、鉤藤。藥材由亳州市康博中藥飲片有限公司提供，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院中藥所馬開副研究員鑒定為正品。馬錢苷對照品(批號111640-201303)、芍藥苷(批號110754-201621)，均購自中國食品藥品檢定研究院。色譜用甲醇、乙腈，德國Merck公司產(chǎn)品；水為重蒸水；其他試劑為分析純。Waters高效液相色譜儀，配有2695分離單元、2996二極管陣列檢測器和Empower Ⅱ色譜工作站軟件，美國Waters公司產(chǎn)品；LIBROR-160DPT萬分之一分析天平，日本島津公司產(chǎn)品；AE240十萬分之一分析天平，瑞士METTLER公司產(chǎn)品；GT-350W超聲波提取器，濟(jì)寧科技超聲電子有限公司產(chǎn)品；DLSB低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵， 鞏義市英峪儀器廠產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法和結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交試驗(yàn)法，對煎煮的主要影響因素和水平進(jìn)行篩選，以煎煮次數(shù) (A)、 煎煮時(shí)間(B)和加水量(C)為考察因素，確定的因素水平表見表1。

表1 因素水平表

按處方比例平行稱取熟地黃、酒萸肉、澤瀉、枸杞子、赤芍和茯苓，共9份，按表1設(shè)定的因素水平表中參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將提取液濾過濃縮后，定容至100 mL，搖勻，作為正交試驗(yàn)樣品溶液。

2.2 馬錢苷的測定

參考《中國藥典》2010版一部山茱萸藥材項(xiàng)下有關(guān)含量測定方法[8-10]，采用高效液相色譜(HPLC)法對正交試驗(yàn)樣品溶液中馬錢苷的含量進(jìn)行測定。

2.2.1 色譜條件

色譜條件：色譜柱為Aligent Zobax C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm )，流動(dòng)相為乙腈-體積分?jǐn)?shù)3 mL /L磷酸溶液(12 ∶ 88)，體積流量1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長240 nm。

2.2.2 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取馬錢苷對照品1.30 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.052 g/L的馬錢苷對照品溶液。

供試品溶液：取2.1項(xiàng)下正交試驗(yàn)1～9號樣品溶液各2 mL，分別置25 mL量瓶中，緩緩滴加乙醇，振搖后定容至刻度，靜置過夜，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 測定方法

分別精密吸取對照品溶液2，5，10，20，25 μL，正交試驗(yàn)供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測定。

2.2.4 結(jié) 果

波長的選擇：按上述色譜條件分別進(jìn)樣馬錢苷對照品溶液10 μL和正交試驗(yàn)供試品溶液10 μL，對色譜中馬錢苷色譜峰在210～400 nm 進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在238～239 nm處有強(qiáng)吸收，且供試品和對照品色譜中馬錢苷峰的紫外吸收光譜基本一致。參照《中國藥典》2015版一部山茱萸[11]27項(xiàng)下含量測定，將測定波長選擇為240 nm。

陰性對照試驗(yàn):按比例稱取除酒萸肉外的其他藥物，加水浸泡后煎煮3次，每次1 h，合并煎液，濃縮至100 mL，作為缺酒萸肉陰性對照藥。按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺酒萸肉陰性供試品溶液，精密吸取對照品溶液10 μL、正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL和缺酒萸肉陰性供試品溶液3～5 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果:供試品溶液在與馬錢苷對照品色譜相對應(yīng)的保留時(shí)間有相對應(yīng)的色譜峰，而缺酒萸肉陰性對照品色譜則在相對應(yīng)的保留時(shí)間無吸收峰檢出。結(jié)果提示：處方中除酒萸肉外的其他藥物對測定無干擾。見圖1。

A.對照品；B.正交試驗(yàn)供試品； C. 缺酒萸肉陰性對照品 圖1 馬錢苷測定的HPLC色譜圖

線性關(guān)系考察：馬錢苷對照品溶液進(jìn)樣2，5，10，20，25 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=1.70×106X-1.74×104，r=0.999 9。結(jié)果表明：馬錢苷在0.104～1.300 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值。 結(jié)果RSD為0.83%，表明本法精密度較好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一正交試驗(yàn)樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密吸取10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值，計(jì)算供試品中馬錢苷的濃度。 結(jié)果RSD為0.79%，表明本法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液10 μL，于制備完成分別放置0，1，2，4，6 h，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值。 結(jié)果RSD為0.89%，表明供試品溶液放置6 h基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn):精密吸取已知馬錢苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.615 g/L的正交試驗(yàn)樣品6份，每份1 mL，置25 mL量瓶中，精密加入用乙醇配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.650 g/L的馬錢苷對照品溶液1 mL，以下按2.2.2項(xiàng)下方法操作制備加樣回收供試品。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算供試品溶液中馬錢苷的總量和馬錢苷的加樣回收率。結(jié)果：馬錢苷的平均加樣回收率為96.28%，RSD=1.53%，n=6。

2.3 芍藥苷的測定

參照《中國藥典》2015版一部赤芍[11]158項(xiàng)下有關(guān)含量測定方法，采用HPLC法對正交試驗(yàn)樣品溶液中芍藥苷的含量進(jìn)行測定。

2.3.1 色譜條件

色譜條件：色譜柱為Aligent Zobax C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm )；流動(dòng)相為乙腈-水(14 ∶ 86)，體積流量1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長230 nm。

2.3.2 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取芍藥苷對照品5.25 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.052 5 g/L的芍藥苷對照品溶液。

供試品溶液：同2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備。

2.3.3 測定方法

分別精密吸取對照品溶液2，5，10，15，20，25 μL，正交試驗(yàn)供試品溶液各3 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

2.3.4 結(jié) 果

測定波長的選擇：按上述2.3.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣芍藥苷對照品溶液10 μL和正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL，對色譜中芍藥苷色譜峰在210～400 nm 進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果均在231～232 nm處有強(qiáng)吸收。參照《中國藥典》2015版赤芍項(xiàng)下含量測定，將測定波長選擇為230 nm。

陰性對照試驗(yàn)：按比例稱取除赤芍外的其他藥物，加水浸泡后煎煮3次，每次1 h，合并煎液，濃縮至100 mL，作為缺赤芍陰性對照藥。按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺赤芍陰性供試品溶液。精密吸取對照品溶液10 μL、正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL和缺赤芍陰性供試品溶液3～5 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果：供試品溶液在與芍藥苷對照品色譜相對應(yīng)的保留時(shí)間有相對應(yīng)的色譜峰，而缺赤芍陰性對照品色譜則在相對應(yīng)的保留時(shí)間無吸收峰檢出。結(jié)果表明：處方中除赤芍外的其他藥物對測定無干擾。見圖2。

線性關(guān)系考察：芍藥苷對照品溶液進(jìn)樣2，5，10，15，20，25 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.70×106X-2.69×103，r=0.999 1。結(jié)果表明：芍藥苷在0.105 0～1.312 5 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液3 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣7次，測定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值。結(jié)果RSD為2.07%，表明本法精密度較好。

A．對照品；B．正交試驗(yàn)供試品； C．缺赤芍陰性對照品 圖2 芍藥苷測定的HPLC色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一正交試驗(yàn)樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密吸取3 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值，計(jì)算供試品中芍藥苷的濃度。結(jié)果RSD為1.44%，表明本法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液3 μL，分別放置0，1，2，4，6 h，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.51%，表明供試品溶液放置6 h基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn):精密吸取已知芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.208 5 g/L的正交試驗(yàn)樣品6份，每份1 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入用乙醇配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.782 g/L的芍藥苷對照品溶液1 mL，以下按2.3.2項(xiàng)下方法操作制備加樣回收供試品。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行3 μL測定，計(jì)算供試品溶液中芍藥苷的總量和芍藥苷的加樣回收率。計(jì)算出的平均回收率為98.74%，RSD=1.18%，n=6。

正交試驗(yàn)結(jié)果:1～9號供試品溶液進(jìn)樣10 μL，按上述2.2和2.3項(xiàng)下色譜條件和供試品溶液制備方法，分別測定正交試驗(yàn)供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的峰面積和濃度，計(jì)算正交試驗(yàn)樣品供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的總量，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以空白列D列作為誤差列，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對A、B、C列進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，各因素統(tǒng)計(jì)處理分析結(jié)果見表3。

表3 馬錢苷正交試驗(yàn)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

對馬錢苷和芍藥苷各因素的不同水平測定結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果：以馬錢苷為指標(biāo)，因素A的一水平與二、三水平間有顯著性差異，二、三水平間有顯著性差異。以芍藥苷為指標(biāo)，因素A的一水平與二、三水平間有顯著性差異，二、三水平間無顯著性差異。

分別以馬錢苷和芍藥苷為指標(biāo)，因素B的一水平與二水平間有顯著性差異，一水平與三水平之間、二水平與三水平間均無顯著性差異。

以馬錢苷為指標(biāo)，因素C的一、二、三水平間均有顯著性差異。

以芍藥苷為指標(biāo)，因素A的一水平與三水平間，二水平與三水平間有顯著性差異，一水平與二水平間無顯著性差異。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析

綜合上述2.2和2.3項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以馬錢苷為指標(biāo)優(yōu)選出的最佳工藝條件為A3B2C3，以芍藥苷為指標(biāo)優(yōu)選出的最佳的工藝條件均為A3B2C3，兩者一致，即熟地黃、酒萸肉、澤瀉、枸杞子、赤芍和茯苓的最佳工藝條件是：藥材加水浸泡2 h后煎煮3次，每次1 h，加水量分別為10倍、8倍和8倍。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

按2.4優(yōu)選出的最佳煎煮工藝條件，稱取2份熟地黃20 g、酒萸肉10 g、澤瀉10 g、枸杞子10 g、赤芍10 g和茯苓10 g，加水浸泡2 h，煎煮3次，每次1 h，加水量分別為10倍、8倍和8倍，合并煎液，濾過，濃縮濾液至100 mL，得到工藝驗(yàn)證用樣品溶液。精密吸取該溶液2 mL，分別置25 mL量瓶中，緩緩滴加乙醇，振搖后定容至刻度，靜置過夜，濾過，取續(xù)濾液，得到工藝驗(yàn)證用供試品溶液。按上述正交試驗(yàn)測定方法，分別測定供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的含量，計(jì)算供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的總量。結(jié)果見表4。結(jié)果表明，按優(yōu)選出的最佳煎煮條件制備的供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的測得量接近或超過了正交試驗(yàn)的最佳結(jié)果，較為理想。

表4 工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 小 結(jié)

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用HPLC法測定正交試驗(yàn)樣品中馬錢苷和芍藥苷的含量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，綜合分析，篩選出了滋陰熄暈丸的最佳制備工藝。經(jīng)工藝驗(yàn)證，本研究所制定的制備工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)，工藝穩(wěn)定性較好。