多層紙基微流控芯片的設計及其對農藥的可視化檢測

楊 鋮,毛罕平,李立治,張凱旋

(江蘇大學 現代農業裝備與技術教育部重點實驗室,江蘇 鎮江 212013)

0 引言

由于農藥的過度使用,農藥殘留超標嚴重,給環境和人類健康帶來威脅。因此,對農藥進行有效的檢測是非常必要的。傳統的農藥檢測方法有光譜法[1]和色譜法[2]等,但非常耗時,且需要的化學品價格昂貴,并要求操作人員技術熟練,不適合實時分析。近年來,微流控芯片以其樣本量需求少、檢測試劑消耗少、污染小、集成小型化與自動化及高通量等特點,在醫療、農業、環境等領域有著廣泛的應用前景[3]。

相比玻璃、石英、PDMS等材料的微流控芯片,以紙為材料的微流控芯片因其成本低廉、制作簡單、不需外力驅動微流體,更符合快速、簡便、低成本、現場檢測的要求[4]。Clémence等[5]利用噴蠟打印的方式制成二維紙芯片用來檢測水中的有機磷酸酯。X Tian等[6]基于碳量子點(CDs)的高靈敏度和選擇性的紙傳感器,檢測地下水中的TNT(2,4,6-三硝基甲苯炸藥)殘留。此方法為開發高靈敏度、選擇性、便捷性和可視化農殘檢測器提供了一種有效的手段,但關于三維紙基微流控芯片混合特性的研究卻很少。

為此,設計了陣列式多層紙基微流控芯片,對混合區的結構進行了優化仿真和試驗研究,以提高混合效率,進而提高農藥的可視化檢測精度。

1 基于熒光內濾效應的可視化檢測原理

熒光內濾效應(Inner Filter Effect,IFE),指當熒光體與吸光物質共存時,由于吸光物質對于激發光或發射光的吸收而導致熒光減弱的現象。其結合熒光探針耦合適配體的特異性,可實現對農藥的可視化檢測,原理如圖1所示。

圖1 基于熒光內濾效應的適配體農藥殘留檢測原理Fig.1 Principle of detection of aptamer pesticide residues based on fluorescence internal rate effect

由于金納米顆粒(AuNPs)的聚集狀態對其光學性質具有一定的影響,在氯化鈉溶液(NaCl)中,AuNPs的表面電荷很容易被NaCl屏蔽,從而導致顆粒間的團聚,AuNPs的吸光度會降低且吸收峰會紅移,熒光探針(CdTe QDs)與AuNPs之間熒光內濾效應會被削弱,CdTe QDs的熒光顏色得到恢復。當加入農藥核酸適配體后,適配體與AuNPs之間的配位作用吸附在其表面,AuNPs增加了抗鹽析能力而分散,熒光內濾效應增強,CdTe QDs熒光顏色變暗;當加入目標農藥分子時,適配體會與目標農藥分子特異性結合,適配體從AuNPs上脫落,AuNPs再次被NaCl誘導發生團聚,由于熒光內濾效應而降低的熒光探針的熒光顏色再次恢復。因此,熒光內濾效應的強弱取決于目標農藥分子的濃度,熒光探針的熒光強弱與目標農藥濃度相關,據此可以實現對農藥殘留熒光可視化檢測。

2 多層紙基微流控芯片的設計

2.1 多層紙芯片整體設計

為了滿足快速、便捷的檢測多種農藥的要求,設計了折疊式多層紙基微流控芯片[7],并采用噴蠟打印的方法制作三維紙芯片[8],通過噴蠟打印機將需要的圖案打印在濾紙表面,加熱使打印在紙上的蠟因高溫而融化,向下滲透到紙的纖維結構中從而形成疏水通道。

圖2(a)是利用AutoCAD設計出來的九宮格紙通道平面圖。圖2(a)中：邊長為6cm正方形由3×3個邊長為2cm的小正方形組成,小正方形的大小即折疊后每層的大小;黑色區域是滲入蠟的疏水區域,白色區域是半徑R為1.5mm的通道,右上角的序號表示折疊后每層的位置。圖2(b)是九宮格式紙的折疊示意圖,將圖2(a)的平面按照圖2(b)的順序折疊,即可得到一個每層邊長為2cm正方形的九層折疊紙芯片,厚度約為1.62mm(每層紙張的厚度約為0.18mm)。

圖2 紙芯片設計以及進樣示意圖Fig.2 Design of paper chip and folding sequence

如圖2(c)所示,此三維紙芯片由3部分組成：第1層為進樣區,i1、i2分別表示農藥的入口和NaCl溶液的入口;2～8層為混合運輸區,其作用是為了保證樣品得到充分混合并將其運輸到反應區域;第9層為反應顯色區。為了滿足農殘可視化檢測的要求,根據熒光法農殘檢測的原理,分別設置了啶蟲脒和丙溴磷兩種農藥的兩個檢測區,還設置了不施加農藥的兩個空白對照區。第1層i1、i2分別表示農藥的入口和NaCl溶液的入口,第9層a1、a2分別是啶蟲脒的檢測區及對照區,紙上固定有啶蟲脒的適配體- CdTe QDs - AuNPs體系;b1、b2分別是丙溴磷的檢測區及對照區,紙上固定有丙溴磷的適配體 - CdTe QDs - AuNPs體系。農藥和NaCl溶液分別從i1、i2口滴入,經過通道Ⅰ混合,在第8層被分配到a1、b1兩個檢測區,同時NaCl溶液也會通過通道Ⅱ最終流到a2、b2兩個對照區。

紙張中的流體輸送是一個被動的過程,通過紙張的毛細作用實現。三維紙芯片通過折疊使得多個流層實現液體的層層滲透,除了每層紙內的流動,還可以在兩層之間垂直流動。這種方法可以使流體能夠在一個緊湊的區域內被輸送到大量反應場所。

2.2 混合通道的結構設計

農藥殘留檢測過程中,多種試劑需要混合均勻以保證化學反應順利進行。在紙基微通道中,試劑混合不均會大大影響檢測的精確性和可靠性。為了在緊湊的區域內實現多種試劑的反應,必須對通道的結構進行設計,盡可能地實現試劑的高效混合。

負責流體混合的兩個基本機制是擴散和對流。在液體中,單獨的分子擴散對于混合效率幾乎沒有提升作用,而是需要通過對流輸送物質來達到更好的混合效果。通過設置障礙物可以使流體在水平方向上的擴散混合距離得以延長,而擴散混合時間的增加對擴散混合效果也有明顯的促進作用;還可以改變通道的寬窄和方向,以達到改變流體的流速和方向,進而實現對流體層的拉伸與折疊,以促進混合。根據上述思路,設計了3種混合結構分別為：半圓環式交錯結構(見圖3)、截圓式交錯結構(見圖4)和圓環式堆疊結構(見圖5)。

(a) 結構軸測圖

(a) 結構軸測圖

(a) 結構軸測圖

管壁障礙物結構主要參數與選值,如表1所示。對以上每一個參考因素d1、d2、d3選擇5個參數值進行仿真,確定參數與混合性能的關系。垂直通道半徑R=1.5mm,高H=1.44mm(混合區共有8層紙,每層紙厚度約為0.18mm)。考慮到紙芯片制作的精度和折疊對齊時的誤差,為保證流動的通道暢通,d1、d2、d3的最大值分別為1200、2000、1200mm。

表1 管壁障礙物結構主要參數與選值Table1 Main parameters and selected values of pipe wall obstacle structure

3 結果與分析

3.1 3種結構的流動混合仿真

3.1.1 混合效果的評價指標

定義評價混合效果的混合強度值Ie[9]為

(1)

3.1.2 3種混合結構的仿真結果

圖6是半圓環式交錯混合結構在環寬d1為 800、900、1000、1100、1200μm時,每層出口處的Ie的對比圖。此外,將沒有障礙物的通道作為對照組。結果顯示,在此結構下,Ie隨著層數增大呈上升趨勢。對比不同參數下混合結構末端(第8層出口)的Ie值得出：當環寬d1在 800～1200μm 范圍內,隨著d1的增大,出口處的Ie值呈現上升趨勢;在d1為1200μm時Ie取最大值為0.599 97。

圖6 半圓環式交錯結構的混合強度值Fig.6 Mixed strength value of semi-circular staggered structure

圖7是截圓式交錯結構在d2為1600、1700、1800、1900、2000μm時,每層出口處的Ie值對比圖。結果顯示：在此結構下,Ie值隨著微通道層數增加整體呈上升的趨勢。對比不同參數下混合結構末端的Ie值得出：當d2在1600 ～ 2000μm范圍內,隨著d2的增大,出口處的Ie值呈現先增大后減小的趨勢,在d2為1700μm時Ie取最大值為0.924 41。

圖7 截圓式交錯結構的混合強度值Fig.7 Mixed strength value of intercepted circular staggered structure

圖8是圓環式堆疊結構在環寬d3為800、900、1000、1100、1200μm時,每層出口處的Ie值對比圖。結果顯示：在此結構下,Ie值隨著層數的增加呈先增后減的趨勢。對比不同參數下混合結構末端的Ie值得出：當d3在800～1200μm范圍內,隨著d3的增大,出口處的Ie值呈現增長趨勢,在d3為1200μm時Ie取最大值為0.398 25。

圖8 圓環式堆疊結構的混合強度值Fig.8 Mixed strength value of circular stacked structure

圖9是半圓環式交錯結構、截圓式交錯結構和圓環式堆疊結構在最優參數下混合強度值的對比圖,將沒有障礙物的通道作為空白對照組。結果顯示：“d2-1700型”截圓式交錯結構的混合強度值Ie最大,混合效果最佳,圓環式堆疊結構的混合強度值Ie最小,混合效果最差。

圖9 圓環式堆疊結構的混合強度值Fig.9 The mixed strength value of the best parameters of three structures

對比以上結果,分析其原因如下：

1)截圓式交錯結構的障礙物能夠將A物質完全引導至B物質入口附近,再同時流向下一層。由于此結構每層之間的通道較窄,因此兩物質在流入下一層的過程中,速度會突然變大再變小,使得流體層拉長;流動過程伴隨著90°的轉向,使得流體層折疊。拉長與折疊可以強化混合效果,所以該結構對混合效果有良好的促進作用。

2)半圓環式交錯結構和圓環式堆疊結構使得A、B兩物質在第一層未發生完全對流就豎直流入了下一層,且在接下來的幾層中,通道結構對速度各分量的變化影響不大,未能引起流體的擾動,使得對流效果較弱,所以直到出口處的混合效果持續表現不佳。

3)在一定范圍內,隨著結構參數越大,水平方向上流動通道的長度越長,微通道混合強度值越大,對微流體速度方向的擾動越強,導致微流體發生更激烈的拉伸和折疊,對微混合效果起促進作用。但是,隨著障礙物的參數超過一定值而繼續增大時,流動通道的寬度隨之減小,流動阻力成為影響流體流速的主要因素,反而會對擴散和對流產生阻礙作用,導致混合效果有所降低。

3.2 多層紙芯片混合試驗

選用甲基橙和甲基藍兩種溶液,滴入“d2-1700型”的三維紙芯片,同時滴入無障礙的通道作為空白對照,展開后觀察混合的效果如圖10所示。圖10(a)是“d2-1700型”結構的混合效果,圖10(c)是“d2-1700型”結構出口處的放大效果,圖10(b)是作為空白對照組,沒有障礙物結構的混合效果,圖10(d)是空白組反應區出口處的放大效果。圖10(e)是將甲基橙與甲基藍混合均勻后滴在紙上所得的效果。

(a) 截圓形結構混合效果圖 (b) 空白組混合效果圖

用圖像處理的方法評價多層紙基微流控芯片的混合效果,定義混合強度值Ie為

(2)

式中N—測量區域內的像素點數目;

ci—每個像素點的灰度值;

圖11 重復性試驗計算混合強度值Fig.11 Calculation of mixed strength value by repetitive tests

3.3 陣列式多層紙基傳感器農藥檢測試驗

分別對啶蟲脒和丙溴磷兩種農藥進行可視化檢測試驗,圖12為不同濃度下(0、50、100、200、400、600、800μg/kg)的啶蟲脒對適配體-CdTe QDs體系在紫外燈下的熒光響應。上排圓形區域為檢測區,下排位對照區。在濃度為0～800μg/kg,隨著啶蟲脒濃度的增大,檢測區CdTe QDs的熒光強度也隨之增強,與對照區的差異越來越明顯;在600～800μg/kg之間的熒光差距較小,肉眼難以分辨,因此其檢測范圍是50 ～600μg/kg,檢測限是50μg/kg,低于國標中的農藥最大殘留限量。

圖12 啶蟲脒濃度(從左到右0～800μg/kg)對適配體-CdTe QDs體系的熒光響應Fig.12 Fluorescence response of acetamiprid concentration (0～800μg/kg) to adaptor -CdTe QDs system

圖13為不同濃度下(0、60、120、240、480、720、960μg/kg)的丙溴磷對適配體-CdTe QDs體系在紫外燈下的熒光響應。

圖13 丙溴磷濃度(從左到右0～960μg/kg)對適配體-CdTe QDs體系的熒光響應Fig.13 Fluorescence response of profenofos concentration (0～960μg/kg) to adaptor -CdTe QDs system

由圖12可知：在濃度為0～480μg/kg內,隨著丙溴磷濃度的增大,檢測區CdTe QDs的熒光強度也隨之增強,與對照區的差異越來越明顯;當超過480μg/kg濃度時,反應區與對照區的差異趨于穩定,反應區與對照區熒光強度的差異較小,肉眼難以分辨,說明其檢測范圍是60～480μg/kg,檢測限值是60μg/kg,低于國標中的農藥最大殘留限量。

4 結論

1)設計了折疊式多層紙基微流控芯片,通過紙張的毛細作用來輸送流體,三維紙芯片折疊結構實現液體的層層滲透,除了每層紙內的流動,還可以在兩層之間垂直流動。此結構可以使流體能夠在一個緊湊的區域內被輸送到大量反應場所。

2)設計了半圓環式交錯結構、截圓式交錯結構和圓環式堆疊結構,對比3種結構的仿真結果,“d2-1700型”截圓式交錯結構的對流擴散的效果最好,混合強度值Ie最大,為0.924 41。

3)對不同濃度的啶蟲脒和丙溴磷兩種農藥進行可視化檢測試驗,測得此芯片對啶蟲脒的檢測范圍是50 ～600μg/kg,對丙溴磷的檢測范圍是60 ～480μg/kg,均低于國標中的農藥最大殘留限量。