閾下劑量鈣拮抗劑的血藥峰濃度測定

林 盛，江澤斌，鄭付春，石剛剛

(1.汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院第一附屬醫院臨床藥理實驗室，廣東 汕頭 515041)

急性心肌梗死是目前死亡率較高的一種疾病，臨床上常用經皮冠狀動脈介入治療手術開通狹窄血管。缺血心肌組織恢復血流后，損傷卻進一步加重，該現象稱為心肌缺血再灌注損傷[1]。本課題組前期研究觀察到C57 小鼠腹腔注射維拉帕米(verapamil，Ver)1.0 mg/kg、硝苯地平(nifedipine，Nif)0.3 mg/kg、地爾硫?(diltiazem，Dil)0.5 mg/kg和碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide，F2)1.0 mg/kg，可以改善小鼠缺血再灌注后的心功能以及減少心肌酶的漏出[2]，該用藥劑量不引起鈣通道阻斷所致的血液動力學變化，我們稱之為“閾下劑量”。臨床研究方案中，以小鼠腹腔注射Ver“閾下劑量”為1.0 mg/kg 折算，患者口服Ver劑量是0.3 mg/kg，大多數患者體重在60～70 kg 之間，因此擬定口服Ver 20 mg 為“閾下劑量”。本研究測定患者口服Ver 20 mg 后的血藥峰濃度，以是否低于阻斷鈣通道所致血液動力學變化的最小有效濃度為標準，判斷其是否為閾下濃度；測定小鼠經腹腔注射“閾下劑量”的Ver、Nif、Dil和F2的血藥峰濃度是否低于最小有效劑量的血藥濃度，判斷其是否為“閾下劑量”。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Ver 對照品(HPLC 級，純度≥99.0%，美國Sigma 公 司 ， 批 號 MKBV4993V)； Ver 注 射 液(上海禾豐制藥有限公司，批號43180401)；Nif 對照品(HPLC級，純度≥98.0%，美國Sigma公司，批號 MKCB9232)； Dil 對照 品(HPLC 級 ， 純 度≥99.0%，美國Sigma 公司，批號MKBW4898V)；F2對照品(HPLC 級，純度≥99.0%，批號20170309)；內標巴馬汀(palmatine，Pal)對照品(HPLC級，純度≥98.0%，大連美侖生物技術有限公司，批號B0613AS)。API 6500 型三重四極桿質譜儀(美國ABSCIEX 公司)；LC-30A 高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 實驗對象

臨床急性心肌梗死患者80例來源于汕頭市潮南民生醫院，本研究經汕頭市潮南民生醫院倫理委員會審核批準，患者均簽署知情同意書。C57BL/6JNifdc 小鼠，SPF 級，雄性，25～30 g，購自北京維通利華公司，許可證編號：SCXK(京)2016-0006。

1.3 給藥方案及血樣采集

急性心肌梗死患者隨機分組，經皮冠狀動脈介入治療手術前口服給藥：(1)實驗組50例，口服含20 mg Ver 注射液的溫水20 mL；(2)安慰劑組30例，口服溫水20 mL。給藥1.5 h(達峰時間1～3 h)后經肘部靜脈采血1 mL，置于一次性靜脈血樣采集容器(EDTA-K2)，4 ℃，3 000 r/min 離心 10 min，-80 ℃冷凍貯存。

小鼠隨機分組，每組6 只，腹腔注射給藥。給藥方案及分組情況如下。(1)閾下劑量：Ver 1.0 mg/kg 組 ，Nif 0.3 mg/kg 組 ，Dil 0.5 mg/kg 組 ， F21.0 mg/kg 組；(2)最小有效劑量：Ver 1.5 mg/kg組，Nif 0.4 mg/kg 組，Dil 0.75 mg/kg 組，F21.5 mg/kg 組。Nif 組于給藥 5、10、15、20 min 后經眼眶后靜脈叢采血，其他藥物組于給藥2、5、10、15 min后經眼眶后靜脈叢采血。每個時間點采血210 μL，置于經EDTA 處理的1.5 mL 離心管中，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，-80 ℃冷凍貯存。

1.4 血藥濃度測定

1.4.1 色譜和質譜條件色譜柱為XB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，保護柱為 XB-C18(5 mm×2.1 mm，1.8 μm)。流動相為乙腈—水溶液(V乙腈∶V水=35∶65，含 2 mmol/L 甲胺與 6 mmol/L 甲酸)，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量3 μL，運行時間11 min，內標為Pal。質譜采用電噴霧離子源，多反應正離子監測(MRM)掃描模式。源電壓：5 300 V；源溫度：450 ℃；氣簾氣：35 psi(1 psi≈6.9 kPa)；碰撞氣：8 psi；霧化氣：45 psi；輔助氣：40 psi；Ver、Nif、Dil、F2、Pal 的監測離子對分別為：m/z455.3→165.2，m/z378.2→315.1，m/z415.0→178.1，m/z432.2→165.1，m/z352.2→336.2。

1.4.2 標準曲線和質控樣品的配制精密稱取各對照品，甲醇溶解并定容，分別配制成200 μg/mL的儲備液，置于-80 ℃冷凍貯存。取適量各分析物儲備液，以甲醇為溶劑配制含3.2 μg/mL Ver、1.6 μg/mL Nif、2.4 μg/mL Dil、2.4 μg/mL F2的混合工作液，逐級稀釋，與空白血漿配制含有2～400 ng/mL Ver、 1～200 ng/mL Nif、 1.5～300 ng/mL Dil、1.5～300 ng/mL F2的標準曲線樣品。配制含有6、160、 320 ng/mL Ver， 3、 80、 160 ng/mL Nif，4.5、120、240 ng/mL Dil，4.5、120、240 ng/mL F2的低濃度(QCL)、中濃度(QCM)、高濃度(QCH)質控樣品。內標Pal儲備液以甲醇為溶劑稀釋2次，配制成1 μg/mL的工作液。

1.4.3 血漿樣品處理取血漿樣品100 μL 至1.5 mL離心管中，加入1 μg/mL的內標Pal 20 μL和乙腈300 μL，渦旋振蕩30 s，-10 ℃，12 000 r/min離心 10 min，取上清液 150 μL 經 0.22 μm 濾膜過濾至進樣瓶。

1.5 方法學考察

1.5.1 選擇性通過比較6 批來自不同供體的空白血漿、標準曲線定量下限(LOQ)血漿樣品(添加了分析物和內標)和真實血漿樣品的色譜圖，當干擾組分的響應低于分析物定量下限響應的20%，并低于內標響應的5%時，即可以接受。

1.5.2 線性和范圍用9 個不同的校正濃度水平對方法的線性進行評價，連續評價6 條標準曲線。以分析物與內標峰面積比值對分析物濃度進行最小二乘法回歸運算，加權系數1/x2，得到相應的方程。

1.5.3 準確度與精密度按1.4.2 配制4 個不同濃度水平(LOQ、QCL、QCM和QCH)的樣品，每批每個濃度水平6 份，連續6 批，按1.4.3 處理，進樣分析，對批內準確度、批間準確度、批內精密度、批間精密度進行統計，質控誤差應在±15%范圍內(定量下限在±20%范圍內)。

1.5.4 回收率與基質效應按1.4.2 配制質控樣品，每個濃度水平6 份，按1.4.3 處理后進樣分析，各對照品峰面積與等濃度水平的甲醇溶液峰面積之比，即為樣品的回收率，要求相對標準偏差在±15%范圍內。使用6 批來自不同供體的空白血漿，從6 批基質計算的內標歸一化的基質因子的相對標準偏差應該在±15%范圍內，在2 個濃度水平(QCL和QCH)進行。

1.5.5 代替基質的驗證按1.4.2 配制人血漿的標準曲線樣品、人血漿的質控樣品3 份、小鼠血漿的質控樣品及定量下限樣品各6份，連續6批，按1.4.3 處理后進樣分析，對批內、批間準確度與精密度進行統計，質控誤差在±15%范圍內(定量下限在±20%范圍內)，符合方法學考察的標準，不影響分析物的定量。

1.5.6 穩定性按1.4.2 配制質控樣品，每個濃度水平3 份，共4 批，分別評估在室溫放置4 h、在進樣器(10 ℃)放置20 h、反復凍融3 次與-80 ℃冷凍貯存3個月的穩定性，偏差應在±15%范圍內。

2 結果

2.1 質譜結果

將5 種對照品溶液分別注入質譜儀，電噴霧正離子模式能產生良好的質譜響應，Ver、Nif、Dil、F2、Pal 豐度最高的碎片離子分別是m/z165.2、m/z315.1、m/z178.1、m/z165.1、m/z336.2。見圖1。

圖1 對照品溶液質譜圖

2.2 方法考察

2.2.1 選擇性在人和小鼠血漿中，Ver保留時間分別為2.81 min 與2.76 min，Nif 保留時間分別為9.43 min 與9.45 min，Dil 保留時間分別為1.79 min與1.77 min，F2保留時間分別為6.77 min 與6.72 min，內標Pal 保留時間分別為1.51 min 與1.53 min，均未觀察到來自內源性物質的干擾(圖2、圖3)，說明本方法具有良好的選擇性，且每種分析物在人和小鼠血漿的保留時間接近。

2.2.2 線性分析物的回歸方程相關系數r均大于0.999，線性關系良好。

2.2.3 準確度與精密度人血漿質控樣品相對偏差與相對標準偏差在±15%范圍內，人血漿定量下限樣品相對偏差與相對標準偏差在±20%范圍內，符合中國藥典2015年版《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[3]對準確度和精密度的要求。

2.2.4 回收率與基質效應人、小鼠血漿質控樣品回收率的相對標準偏差在±15%范圍內，基質效應相對標準偏差在±15%范圍內，符合《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[3]對基質效應的要求(回收率未作要求)。

圖2 急性心肌梗死患者血漿LC-MS/MS色譜圖

2.2.5 代替基質的驗證小鼠血漿質控樣品的相對偏差與相對標準偏差在±15%范圍內(定量下限樣品在±20%范圍內)，符合方法學考察的標準[3]，不影響分析物的定量，見表1，后續實驗可以使用人血漿代替小鼠血漿配制標準曲線。

2.2.6 穩定性由新鮮配制的標準曲線分析穩定性實驗的質控樣品，結果表明，質控樣品的偏差均在±15%范圍內，說明在室溫放置4 h、進樣器10 ℃放置20 h、反復凍融3 次與-80 ℃冷凍貯存3個月的穩定性良好，符合《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》對穩定性的要求[3]。

2.3 方法學應用

2.3.1 患者Ver“閾下劑量”血藥峰濃度測定本方法成功應用于臨床急性心肌梗死患者的Ver 血藥峰濃度測定，經皮冠狀動脈介入治療術前口服單劑量Ver注射液20 mg，在服藥后1.5 h經肘部靜脈采血1 mL，含藥血漿按1.4.3處理進樣。50例患者血樣中49 例的Ver 血藥峰濃度低于產生鈣通道阻斷作用的最小有效濃度20 ng/mL[4]，基本符合預期。見圖4。

2.3.2 小鼠鈣拮抗劑“閾下劑量”血藥峰濃度的測定本方法亦應用于小鼠血漿中Ver、Nif、Dil和F2濃度的測定，“閾下劑量”鈣拮抗劑Ver、Nif、Dil、F2的血藥峰濃度分別是 62.62、85.28、44.52、99.87 ng/mL，均低于其最小有效劑量的血藥濃度84.58、97.45、45.55、133.00 ng/mL。見圖5。

圖4 急性心肌梗死患者的Ver血藥峰濃度

表1 分析物在小鼠血漿中批內、批間的準確度與精密度(n=6)

圖5 小鼠鈣拮抗劑“閾下劑量”與最小有效劑量血藥濃度

3 討論

鈣拮抗劑血藥濃度的測定方法已有報道[5-8]，但Nif的靈敏度不滿足本研究的需求。通過添加甲胺[9-11]，提高了Nif 的質譜響應，定量下限1 ng/mL滿足研究需求。根據《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[3]，配制標準曲線及質控樣品的基質應該與目標實驗樣品基質相同，改變其他基質或物種需要部分方法驗證。代替基質的研究已有報道[12-13]，本研究通過觀察選擇性、回收率、基質效應、準確度與精密度，確證了人血漿可代替小鼠血漿配制標準曲線樣品，減少小鼠的實驗數量。

本課題組前期研究結果表明，最小有效劑量的Ver、Nif、Dil 和F2引起小鼠血流動力學變化的時間遠遠滯后于達峰時間，所以最小有效濃度難以確定[2]。本研究測得以上4種鈣拮抗劑“閾下劑量”的血藥峰濃度低于最小有效劑量的血藥濃度，結合前期研究“閾下劑量”未引起鈣通道阻斷所致的血液動力學變化，基本確定腹腔注射Ver 1.0 mg/kg、Nif 0.3 mg/kg、Dil 0.5 mg/kg 和 F21.0 mg/kg 是不引起鈣通道阻斷所致血液動力學變化的閾下劑量。

另一方面，本研究發現臨床急性心肌梗死患者Ver 血藥峰濃度低于臨床最小有效濃度，確定了急性心肌梗死患者口服Ver 注射液20 mg 是Ver的閾下劑量。根據臨床術前環境，本研究選擇口服注射液的給藥方式，考慮到劑型的差異是否影響Ver 血藥濃度，也測定了口服Ver 注射液20 mg與片劑20 mg的血藥峰濃度，結果表明，兩種劑型的血藥峰濃度差異沒有統計學意義(P=0.29)。

綜上所述，本研究證實了急性心肌梗死患者口服Ver注射液20 mg的劑量是閾下劑量，小鼠腹腔注射Ver 1.0 mg/kg、Nif 0.3 mg/kg、Dil 0.5 mg/kg和F21.0 mg/kg 的劑量也基本確定為閾下劑量，為應用鈣拮抗劑治療心肌缺血再灌注損傷采用的“閾下劑量”提供了佐證。