鐵及鐵死亡在肺癌方面的研究近況

俞華林，李鵬飛，汪麗，張春，楊勁松

(1.南京醫科大學附屬南京醫院(南京市第一醫院)腫瘤內科,南京260000; 2.南通大學附屬醫院眼科,江蘇 南通226001)

隨著技術信息時代的不斷革新，越來越多的疾病及其發生發展機制被重新認識，腫瘤便是當前急需被更深層次挖掘的一大類疾病。腫瘤治療方案的不斷更新為解決民生問題提供了重要保障，其中肺癌的研究不斷取得新突破，為人類帶來了新希望。肺癌是全世界范圍內癌癥相關性病死率的主要原因，降低肺癌患者病死率不僅提高了人們戰勝更多疾病治療的信心，也將加快人類醫藥歷史進步的新步伐[1]。肺癌及支氣管癌仍然是美國癌癥-死亡的主要原因，近10年，轉移性非小細胞肺癌患者總生存率不到5%，可見解決肺癌的治療問題仍是全人類的一大難題[2]。雖然目前有關肺癌發生發展的機制尚未完全明確，但是肺癌的高復發性預示了其預后極差，因此更好地了解有關肺癌發生發展機制將有助于指導臨床治療[3]。當前備受研究者們關注的一方面是人體微量元素：鐵及其所參與的各種代謝過程；另一方面是一種新的細胞死亡模式，鐵死亡。有關鐵死亡的研究早在20世紀末就有報道，但目前關于肺癌鐵死亡的研究甚少。現就鐵、鐵代謝及鐵死亡在肺癌中的研究進展予以綜述。

1 鐵在機體的正常代謝

人體的正常生長離不開各種微量元素的調節，鐵是最重要的膳食元素之一。許多重要的生物過程中均需要鐵，包括氧轉運(血紅蛋白中的血紅素)、DNA生物合成(作為核糖核苷酸還原酶的輔助因子)和ATP生成(作為檸檬酸循環和電子轉運鏈中許多蛋白質的輔助鐵因子)。鐵具有氧化還原活性，可產生活性氧類(reactive oxygen species，ROS)，導致氧化應激并啟動對于細胞存活和細胞死亡至關重要的信號通路。

西方人每天攝入鐵20～30 mg，中國人每天攝入鐵10～15 mg。食物中含血紅素鐵(有機)和非血紅素鐵(無機)，血紅素鐵在鐵總量中所占比例較小，主要存在于紅肉中，由于鐵鹽的不溶性，其較非血紅素鐵更易被人體吸收(15%～40%)[4]。此外，血紅素鐵可以作為一種亞硝化參與致癌過程，形成已知的致癌物質n-亞硝基化合物，進一步說明食用過量紅肉的致癌性[5]。非血紅素鐵是鐵總量的主要組成部分，主要存在于谷類、豆類和一些蔬菜中。人體對鐵的吸收主要受體內鐵儲存量、缺氧和促紅細胞生成素活性的影響[6]。維生素C能夠極大地增強非血紅素鐵的吸收，而鈣對兩種形式的鐵的吸收均起作用[7]。

機體鐵代謝穩態包括鐵攝入、儲存及轉運的動態平衡穩態。維持機體鐵代謝穩態物質有鐵蛋白、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體1、二價金屬離子轉運體1、運鐵素(唯一已知的細胞鐵外排泵)、鐵調素等。白細胞介素-6和脂質-2是目前研究較為明確的在鐵儲存及轉運穩態中起作用的物質[8]。

非血紅素鐵在鐵還原酶(如十二指腸細胞色素B還原酶)的作用下，在腸腔內由Fe3+還原為Fe2+，并通過二價金屬離子轉運體轉運至腸細胞。而血紅素鐵是通過一種機制尚不明的方式被腸道細胞所吸收，并由血紅素加氧酶1代謝，釋放Fe2+。通過體外吸收的鐵是由膜鐵轉運蛋白運送到循環中，膜鐵轉運蛋白一種高度穩定的多跨膜蛋白，也是已知的哺乳動物中唯一參與鐵輸出的蛋白。通過膜鐵轉運蛋白轉運輸出的Fe2+在腸上皮細胞基底外層由膜結合的多銅氧化酶催化再氧化，之后再加載在運鐵蛋白上(運鐵蛋白是一種在血漿中循環并將鐵輸送到外周組織的蛋白質)，全轉移蛋白(與兩個鐵原子結合)通過與大多數細胞表面表達的運鐵蛋白受體結合，將鐵傳遞給細胞，隨后運鐵蛋白受體1/運鐵蛋白復合體發生內吞作用，將鐵運入細胞內。在機體中，Fe3+經鐵還原酶還原為Fe2+，并通過二價金屬離子轉運體1在內生膜中運輸，輸入的Fe2+參與鐵代謝，瞬間轉入鐵池中。細胞內鐵池可以進行如下幾種功能：①與鐵依賴酶和蛋白質結合行使功能；②與血紅素(線粒體膜轉運后)和鐵硫團簇結合發生反應；③儲存鐵蛋白。多余的鐵由鐵泵蛋白輔助輸出。通過這些過程吸收的鐵在巨噬細胞中被有效回收，巨噬細胞吞噬衰老的紅細胞，從血紅蛋白中提取鐵，并通過鐵泵蛋白介導的外排將鐵運送回循環。系統肽激素鐵調素與鐵泵蛋白結合，促進其磷酸化使溶酶體降解，對網狀內皮系統的腸鐵吸收和鐵循環均有負調控作用。血清鐵被認為是體內鐵儲備的一種較低特異性的標志物，而轉鐵蛋白飽和度已被證明能較好地反映組織鐵儲備[9]。直到研究者對鐵調控蛋白(如轉運蛋白、還原酶、氧化酶、調控蛋白和鐵外排泵)的鑒定做出突破性進展后，人們才能夠準確地理解鐵在細胞和組織中的轉運，為后續研究的展開鋪墊了堅實的基石[10]。鐵代謝的新調節劑，包括運鐵蛋白、溶質載體家族39，也稱為鋅鐵調控蛋白，包含14個成員，傳統上被理解為包含跨膜鋅轉運蛋白，可將細胞外Zn2+泵入細胞內。研究發現了兩種鋅鐵調控蛋白-在鐵運輸中起到至關重要的作用[11]。另外聚-結合蛋白在釋放鐵蛋白結合的鐵過程中起到了接受貨物受體的作用[12]。ROS是一種高度反應的分子，能夠誘導脂質過氧化和DNA氧化損傷，從而促進腫瘤生長[13]，ROS在細胞死亡中的研究已相對透徹，而在肺癌鐵死亡機制通路中的研究目前尚少。Yang等[14]研究發現，使用鐵螯合劑或敲除核受體共激活劑4可以防止青蒿琥酯誘導的細胞凋亡，可能與青蒿琥酯和增加的溶酶體鐵反應生成ROS有關，但具體上游下游及關鍵通路還不明確。

2 鐵異常與腫瘤

早年研究者證實，鐵代謝失調和過量的鐵積累可增加癌癥風險，促進腫瘤生長，已有多個實驗及流行病學研究證實了這一點[15]。雖然鐵在氧化還原反應中起著重要作用，并作為體內酶反應的輔助因子，但是鐵在人體蓄積超負荷時，可通過產生ROS增加癌癥風險[16-17]。在癌細胞中，研究者已經觀察到控制編碼調控鐵蛋白的轉錄本的機制受到干擾，包括微RNA、甲基化和乙酰化的差異，這些新發型可能最終為治療癌癥提供新的方案選擇。

有研究證明，低頻磁場通過抑制細胞鐵代謝、穩定p53蛋白、激活p53-miR-34a-E2F1/E2F3通路抑制肺癌發生發展[18]。也有研究表明，一些藥物可以通過激活鐵離子產生抗腫瘤作用，如柳氮磺吡啶和青蒿琥酯[19]。與正常細胞相比，癌細胞對鐵的依賴性更強，表現為癌癥患者體內鐵大量流失，這種現象稱為鐵成癮[20]。腫瘤患者體內鐵失調常引發腫瘤患者的癌癥相關性貧血。有研究發現，表皮生長因子受體通過鐵蛋白的再分配調節鐵的穩態，增加細胞鐵的輸入，促進肺癌的發展[21]。

鐵具有催化氧化還原反應的能力，鐵治療可能與氧化應激有關，肺是唯一易受氧化應激影響的器官，關于鐵治療的相關研究也將受到研究者的關注。流行病學調查顯示，低頻磁場對機體生長及疾病發生有影響[18]。體外實驗研究證實，低頻磁場可以誘導細胞生長停滯、細胞衰老，抑制肺癌細胞鐵代謝，Fonseca-Nunes等[16]研究小鼠肺癌模型發現低頻磁場(0.4 T,7.5 Hz)，通過激活p53-miR-34a-E2F1/E2F3通路抑制鐵代謝，進而抑制肺癌生長。可見鐵元素的物理特性在肺癌乃至腫瘤的藥物治療、物理治療均可能發揮巨大作用。Wang等[22]研究表明，氧化鐵磁性納米顆粒是一種具有生物相容性和低毒性的納米材料，聯合一種從黃連根莖中分離得到的三萜苷類化合物誘導細胞凋亡，以p53依賴的方式抑制非小細胞肺癌的生長。鐵代謝失調引發肺癌的詳細機制還有待進一步研究。

3 鐵死亡

鐵死亡是一種由有毒脂質過氧化集聚引起的非凋亡形式的細胞死亡方式，由Dixon等[23]在RAS(rat sarcoma)選擇性小分子藥物研究中提出，是一種具有鐵離子依賴性、氧化型的細胞死亡方式。鐵死亡無論在形態學、生物合成還是基因水平上與目前已知的細胞凋亡、副凋亡、脹亡、自噬、壞死、角化、焦亡及其他形式的細胞死亡均不同。細胞內ROS的積累是鐵死亡的直接原因之一。

研究觀察到高間充質細胞狀態在人類癌細胞系和細胞質中的耐藥特性，它依賴于一種可藥物化的脂質過氧化物酶途徑，這種途徑可防止鐵中毒[24]。Yang等[25]研究這種脂質代謝依賴于聚集在磷脂谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)4上的通路，GPX4是一種含硒半胱氨酸的酶，能分解脂質過氧化物，阻止鐵介導的過氧化物反應，導致鐵死亡。鐵死亡是一種鐵依賴的細胞調節性死亡方式，而調節性細胞死亡在維持正常細胞的生長、內環境穩定以及快速增殖類疾病(如腫瘤)的發生發展中具有重要作用。具有代表性的調節性細胞死亡方式的比較，見表1。

有關鐵死亡發生的機制，目前研究主要有三大類：鐵穩態[37]、氧化應激[38-39]、谷氨酸異常所引起的興奮性毒性[40]。三者相輔相成、相互作用，共同促進鐵死亡的發生發展。鐵死亡的形態學特征主要為掃描電鏡下內質網的皺縮、內質網膜密度的增加，而線粒體氧化呼吸鏈傳遞受損所致的氧化還原損傷主要為線粒體腫脹[41]。鐵死亡在代謝方面的改變主要包括：①細胞內還原型谷胱甘肽減少，導致細胞內還原解毒系統受損；②細胞內鐵聚焦；③脂質過氧化細胞膜以及亞細胞器膜發生脂質過氧化[42]。現階段鐵死亡檢測主要基于以上三點代謝改變，如細胞內谷胱甘肽檢測、鐵檢測、丙二醛檢測[43]。鐵死亡在基因組學方面主要是以谷氨酸/胱氨酸轉運系統以及下游的GPX4為中心的基因蛋白組學研究。研究表明，含鐵血紅素加氧酶-1在鐵死亡通路中發揮了作用，缺氧誘導因子通過鐵死亡相關基因(儲鐵效應元件結合蛋白2基因、ATP5G3、Cs及Rp18)影響鐵死亡進程[44]。

4 鐵死亡在肺癌方面的研究

鐵死亡主要聚焦于腫瘤、神經系統等疾病的發生方面。Yagoda等[45]在K-ras突變的A549肺癌細胞中發現鐵死亡。近年來文獻報道，野生型和突變型的p53均可以在ROS累積的條件下，通過抑制細胞表面氨基酸運載蛋白的表達，阻止細胞攝取胱氨酸誘導細胞鐵死亡[46]。Vu和Vassilev[47]研究發現，半胱氨酸脫硫酶是一種鐵硫團簇生物合成酶，它從半胱氨酸中攝取硫并用于生物合成鐵硫族，是氧化損傷敏感的蛋白質輔因子，存在于48種人類酶中，并通過維持鐵硫輔因子，在高氧張力下保護細胞不發生鐵死亡。半胱氨酸脫硫酶和細胞色素轉運的協同抑制可在體外誘導鐵離子增多，抑制腫瘤生長。高氧濃度可加速鐵硫族的降解，而充足的鐵硫族是保證腫瘤細胞行使基本功能的重要基礎。研究發現，肺癌中可以檢出半胱氨酸脫硫酶，位于肺腺癌中存在的基因組擴增區域，在分化良好的腺癌中表達最高。這種酶對肺癌細胞的生長必不可少，它的檢出進一步說明了鐵硫族在肺癌細胞中需求量大，一旦鐵硫族匱乏就會通過刺激鐵饑餓反應激活肺癌細胞鐵死亡敏感通路[48]。鐵死亡誘導原件和鐵死亡在肺癌的發生發展中起著不可或缺的作用。

表1 具有代表性的調節性細胞死亡方式的比較

Matsushita等[46]通過高通量篩選發現第一個鐵死亡誘導復合物Erastin和ras選擇性致死化物3。Erastin是一種鐵死亡誘導劑，可以抑制胱氨酸的導入，并降低谷胱甘肽水平，從而誘導鐵死亡。Erastin在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、白血病等中誘導鐵死亡均有報道[49]。胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路的激活被認為是鐵死亡的標志之一，ERK水平與鐵死亡進程呈正相關[50]。鐵螯合劑主要阻斷鐵死亡發生，目前已用于臨床治療，包括親脂性鐵螯合劑(氧合酶、氧化性多不飽和脂肪酸、去鐵胺)。體內、體外及臨床前研究證明，鐵螯合劑可抑制腫瘤的生長，為腫瘤的治療進一步提供了選擇方案；但臨床數據顯示，許多腫瘤鐵螯合劑對腫瘤無效，包括肺癌[51]，可能與鐵螯合劑在實體腫瘤中的藥動學相關，也可能與晚期肺癌細胞低氧濃度有關。所以，不能排除鐵螯合劑對早期肺癌細胞有效的可能，這也為研究早期肺癌治療提供了新思路。目前關于鐵死亡誘導劑的實驗室和臨床研究均逐步增多，誘導鐵死亡的臨床研究藥物見表2，誘導鐵死亡的實驗研究藥物見表3。

鐵死亡是一種程序性壞死，其免疫原性較凋亡強。由于與分子模式釋放相關的損傷，鐵死亡過程被認為是一種促炎過程，但是研究者們認為鐵死亡與壞死性炎癥之間并沒有直接關聯。鐵死亡通過傳遞趨化信號，在腫瘤部位具有招募和激活免疫細胞的能力，為鐵死亡誘導劑作為檢查點抑制劑等抗腫瘤免疫治療增強劑提供了可能。事實上，當小鼠腫瘤異種移植體在超細納米顆粒誘導下發生鐵死亡時，腫瘤內可觀察到大量免疫細胞。雖然目前對鐵死亡誘導物所發揮作用的機制了解尚少，但鐵死亡可能為逆轉耐藥性和增強宿主免疫系統提供一種新的抗癌治療方案。盡管鐵死亡在癌癥治療中被寄予了很高的希望，但在臨床前期研究和臨床應用中仍有大量問題亟須解決，如在不同研究背景下觀察p53或ras突變的癌細胞存在的復雜性；另外，GPX4作為鐵死亡抑制劑會影響神經系統和腎臟的發育功能，這些均增加了研究和實現臨床應用的難度。

表2 誘導鐵死亡的臨床研究藥物

表3 誘導鐵死亡的實驗性研究藥物

研究發現，順鉑是A549和HCT116細胞中鐵死亡及細胞凋亡的誘導劑，其機制可能與順鉑引起的還原型谷胱甘肽的消耗和GPX4的失活有關[57]。此外，順鉑和Eaststin的聯合治療對抗腫瘤活性顯示出明顯的協同作用，可能與谷胱甘肽下調以及GPX失活刺激Erastin通路有關，最終導致肺癌細胞通過鐵離子減少對順鉑產生敏感性，為包括肺癌在內的許多腫瘤化療藥提供了抗癌新思路。Gai等[62]研究出對乙酰氨基酚通過對非小細胞肺癌NRF2-血紅素加氧酶-1信號通路的調控，進一步增加Erastin的敏感性進而誘導鐵死亡。根據ONCOMINE數據庫、臨床標本和細胞操作的結果顯示，GPX4在非小細胞肺癌組織和細胞系中表達上調,GPX4在大多數腫瘤組織中表達水平高于正常組織；GPX4在肺腺癌中表達水平高于肺鱗癌，而高表達的GPX4預測肺癌預后極差。Lai等[63]研究發現，絲氨酸蘇氨酸酪氨酸激酶1與GPX4在非小細胞肺癌中均高表達，過表達的絲氨酸蘇氨酸酪氨酸激酶1可以抑制鐵死亡，通過敲低GPX4可以逆轉這種抑制作用。具體作用通路還有待研究者深入挖掘。周期蛋白依賴性激酶是細胞周期轉變的驅動因子。Kuang等[64]研究表明，周期蛋白依賴性激酶1抑制劑和鐵缺乏是針對信號通路糖蛋白130/信號轉導及轉錄激活因子3靶點的潛在治療肺癌策略。目前已有研究顯示，鐵死亡在胰導管腺癌、肝癌、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、膠質瘤等腫瘤發生發展的通路機制。而更多關于鐵死亡在肺癌的機制通路及治療方案尚待進一步探索。

目前有關血清鐵水平與肺癌風險的評估性研究較多，雖然減少鐵在肺癌患者體內的貯存有利于抑癌，但這并不一定意味著血清鐵水平的升高就一定會促進肺癌的生長。有薈萃分析表明，血清鐵水平與肺癌風險無顯著相關性[51]。而Ward等[65]的一項前瞻性研究顯示，較高血清鐵的攝入與肺癌風險有一定關系。因此，相關研究有待持續跟進。

5 小 結

鐵死亡在抗腫瘤治療中有很大潛力，為一些藥物的臨床效用研究提供了新途徑，起到老藥新用、新藥再用的效果。但是仍有很多問題尚待研究，如鐵死亡激發機體免疫原性引發機體適應性的具體發生分子機制目前仍不清楚；在鐵死亡發生機制中，具體哪些脂類物質被氧化，以及在分子水平是通過何種方式與其他細胞死亡形式相互作用等問題亟待解決。對鐵死亡的深入研究有助于更充分認識相關疾病的發生進展機制。鐵死亡抑制劑在一定程度上能夠延緩疾病進程，減輕患者病情，這可能作為今后基礎機制研究和臨床應用的切入點，在腫瘤的治療和預防中發揮作用。隨著肺癌檢出率的提高，在原有的手術、化療、放療、分子靶向、免疫治療等治療基礎上，更多新的有效治療不斷被挖掘。