新疆2種苜蓿葉斑病病原菌主要生物學特性

竇曉麗，胡文靜，劉 凡，林彩英，李克梅

(1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2.昌吉農業技術推廣中心，新疆昌吉 831100)

0 引 言

【研究意義】苜蓿產量高、品質優，因其具有強大的固氮和恢復植被、保持水土能力，常用于改良土壤，恢復生態，在新疆被廣泛種植[1，2]。調查新疆苜蓿病害時發現了2種癥狀不同的葉斑病，經過對病原菌分離、致病性測定，病原鑒定系列研究，確定為由苜蓿莖點霉(Phomamedicaginis)和囊狀匍柄霉(Stemphyliumvesicarium)引起的苜蓿莖點霉葉斑病及苜蓿匍柄霉葉斑病[3，4]。研究分析這2種病原菌的生物學特性，為研究該病害的發生規律、抗病品種選育及綜合防控提供理論依據。【前人研究進展】苜蓿莖點霉葉斑病，又稱春季黑莖病或者輪紋病，是一種毀滅性病害，在歐洲、美洲廣泛分布[5，6]，非洲也有報道[7]；在我國甘肅、吉林、陜西等地均有發生[8-10]。嚴重發生時，苜蓿葉片提早脫落，造成干草、種子減產，種子發芽率和千粒重降低，嚴重影響牧草質量[11]。Chung等[12]研究了不同溫度、光照等條件對苜蓿莖點霉生長的影響，發現分生孢子器和分生孢子形成的最適溫度為30和20℃，持續光照有利于其生長。張麗[9]研究表明，苜蓿莖點霉吉林菌株最適生長條件為20℃、V8培養基、全光照、蔗糖和牛肉膏上生長最佳，菌絲致死溫度為50℃。李洪建[10]研究發現，苜蓿莖點霉陜西菌株最適生長條件為25℃、pH值為7、淀粉和牛肉膏為最佳碳源和氮源。苜蓿匍柄霉葉斑病是地理分布極為廣泛的一種苜蓿病害，發現于美國，在加拿大、德國、波蘭、新西蘭等多國均有此病發生，我國吉林、黑龍江、江蘇、甘肅、寧夏、新疆、陜西等省(區)發現該病[11-14]。苜蓿匍柄霉葉斑病影響苜蓿的生長，造成落葉、種子減產、發芽率降低、嚴重影響牧草產量和品質[8]。引起苜蓿匍柄霉葉斑病的病原菌有匍柄霉(Stemphyliumbotryosum)、枯葉匍柄霉(S.herbarum)、紫花苜蓿匍柄霉(S.alfalfa)、球孢匍柄霉(S.globuliferum)和囊狀匍柄霉(S.vesicarium)、束狀匍柄霉(S.saciniiform)[8，15]。由囊狀匍柄霉引起的苜蓿匍柄霉葉斑病在非洲南部、阿根廷曾被報道[17，18]，在我國尚未見報道。王雪薇等[15]認為新疆南疆地區發生的苜蓿匍柄霉葉斑病病原菌為束狀匍柄霉。針對苜蓿匍柄霉葉斑病，張靜妮[19]研究發現，最適合匍柄霉菌絲生長及產孢的培養基是V8培養基，最適溫度為25℃，苜蓿品種公農1號、慶陽、BL-201對苜蓿匍柄霉葉斑病抗性最好；黃寧[20]選用44個苜蓿材料對匍柄霉葉斑病進行了抗病評價及抗性評價標準對照品種篩選，得到抗病品種15份、中抗病品種22份、感病品種7份，篩選出抗病對照品種為皇冠，中抗病對照品種為新牧1號，感病對照品種為賽特。【本研究切入點】關于苜蓿莖點霉和囊狀匍柄霉新疆種群的生物學特性尚未見系統報道。苜蓿莖點霉葉斑病和匍柄霉葉斑病在新疆僅有發生報道，但是對其病原菌的分類地位、病害發生規律、病原菌生物學特性均缺少明確描述。研究不同培養基、溫度、不同碳源、氮源等對苜蓿莖點霉和囊狀匍柄霉菌絲生長的影響。【擬解決的關鍵問題】在不同培養基、溫度、碳源、氮源條件下，培養P.medicaginis(代表菌株PM-1)7 d，培養S.vesicarium(代表菌株SV-1)5 d，觀察菌落及菌絲生長狀況，用十字交叉法分別測量這2種病原菌菌落直徑大小，采用SPSS 20.0軟件分析各處理間的差異，分析其生物學特性，掌握病原菌最適培養條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病株

供試病菌苜蓿莖點霉(代表菌株PM-1)及囊狀匍柄霉(代表菌株SV-1)由該實驗室分離鑒定保存。

1.1.2 供試培養基

供試11種培養基，包括PDA、PCA、SA、GPA、MA、YEA、OMA、CA、PSA、CMA、Czapek，按照方中達[21]植病研究法配置培養基，滅菌后常溫保存備用。

1.2 方 法

1.2.1 不同培養基對菌絲生長的影響

無菌條件下，在苜蓿莖點霉(25℃生長7 d)和囊狀匍柄霉(25℃生長5 d)菌落邊緣分別取5 mm菌餅，將菌餅正面朝下分別放于11種不同供試平板培養基中央(培養皿直徑75 mm)，25℃恒溫培養，每處理3次重復，苜蓿莖點霉生長7 d、囊狀匍柄霉生長5 d，用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落形態[22]，下同。

1.2.2 不同溫度對菌絲生長的影響

分別對2種病原菌進行打孔、接種，將菌餅接種至PDA培養基中央，在5、10、15、20、25、30和35℃下恒溫培養，每處理3次重復，十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 不同光照對菌絲生長的影響

對2種病原菌進行打孔、接種，分別置于24 h持續光照、12 h光暗交替、24 h持續黑暗，25℃恒溫培養，每處理3次重復，十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響

將PDA培養基作為基礎培養基，按照葡萄糖的量，分別稱取等量的麥芽糖、L-脯氨酸、淀粉、甘露糖、D-木糖、菊糖、山梨醇進行置換，配置成8種培養基。分別對2種病原菌進行打孔、接種并測量。

1.2.5 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響

以PDA為基礎培養基，按照2 g尿素的量，分別加入牛肉膏、硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸鈉、磷酸二氫銨、草酸銨、尿素、L-谷氨酰胺、酵母膏進行等量置換，配成11種培養基。分別對2種病原菌進行打孔、接種并測量。

1.2.6 菌絲致死溫度測定

取5 mL無菌水管預熱至40、45、50、55、60和65℃，待溫度恒定時，分別將打取的2種病原菌菌餅放入試管中搖勻，再對應置于上述溫度的水浴鍋中，恒溫處理10 min，取出試管后迅速冷卻，接種并測量。

1.3 數據處理

采用統計軟件SPSS 20.0對所測數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌絲生長的影響

2種病原菌在供試的11種培養基上均能生長，且存在顯著差異，在大多數培養基上生長良好。苜蓿莖點霉在PSA、GPA培養基上生長最快，菌落直徑分別為48.33、48.67 mm；在PSA培養基上氣生菌絲長而疏松，GPA培養基上菌絲較短且致密。囊狀匍柄霉在GPA培養基上菌絲生長最快，菌落直徑為54.67 mm；其次為PSA、PDA培養基，菌落直徑均為53.33 mm。圖1

注：不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)

2.2 不同溫度對菌絲生長的影響

2種病原菌在不同溫度下菌絲生長存在顯著差異，其生長趨勢隨溫度的變化基本一致，在20～25℃時生長較為適宜，最適溫度為25℃。苜蓿莖點霉在35℃時不生長，但囊狀匍柄霉仍可緩慢生長。圖2

圖2 不同溫度下苜蓿莖點霉和囊狀匍柄霉菌絲生長變化

2.3 不同光照對菌絲生長的影響

研究表明，在3種不同光照處理下，苜蓿莖點霉的菌絲生長存在顯著差異，24 h持續光照菌絲生長最快，24 h持續黑暗菌絲生長最慢，持續光照條件下更適合苜蓿莖點霉生長。不同光照處理對囊狀匍柄霉生長影響差異不顯著。圖3

注：不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)

2.4 不同碳源對菌絲生長的影響

研究表明，2種病原菌在8種碳源條件下均可生長，且存在顯著差異。苜蓿莖點霉在含麥芽糖、葡萄糖、L-脯氨酸的培養基上菌絲生長最佳，菌落直徑分別為44、42.67 和41.50 mm；在含甘露糖的培養基上菌絲生長最差，菌落直徑僅為27.33 mm。囊狀匍柄霉在含菊糖的培養基上菌絲生長最佳，菌落直徑為52.83 mm；葡萄糖、L-脯氨酸次之，菌落直徑分別為51.33、50.17 mm；在含麥芽糖的培養基上菌絲生長最差，菌落直徑僅為27.50 mm。圖4

注：不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)

2.5 不同氮源對菌絲生長的影響

2種病原菌在11種氮源條件下均可生長，且存在顯著差異。苜蓿莖點霉在含L-谷氨酰胺的培養基上菌絲生長最佳，菌落直徑為44.33 mm；尿素次之，菌落直徑為35.33 mm；硫酸銨最差，菌落直徑僅為18.00 mm。囊狀匍柄霉在含L-谷氨酰胺的培養基上菌絲生長最佳，菌落直徑為51.83 mm；胰蛋白胨次之，菌落直徑為49.67 mm，磷酸二氫銨最差，菌落直徑僅為20.33 mm。圖5

注：圖中不同小寫字母間差異顯著(P<0.05)

2.6 病菌致死溫度

研究表明，2種病原菌菌絲在40～65℃處理后，菌絲生長存在顯著差異。苜蓿莖點霉在處理溫度≥55℃時，菌絲不生長，故其致死溫度為55℃。囊狀匍柄霉在處理溫度≥60℃時，菌絲不生長，故其致死溫度為60℃。圖6

圖6 不同水浴溫度處理下菌絲生長變化

3 討 論

苜蓿莖點霉和苜蓿匍柄霉葉斑病在新疆苜蓿種植區普遍發生，在準確鑒定病原菌的基礎上，對2種病原菌的生物學特性進行研究，摸清2種病原菌的最適生長條件，為該病害的防治研究提供理論依據。研究表明，苜蓿莖點霉新疆菌株最適生長溫度為25、30℃時菌絲生長明顯開始受到抑制，與李洪建[10]的研究結果一致；全光照有利于該菌生長，與張麗[9]的研究相符。苜蓿莖點霉的最適培養基為GPA、PSA培養基，最適碳、氮源分別為麥芽糖和L-谷氨酰胺，這與張麗、李洪建[9，10]的研究結果存在一定差異，可能是采用的培養基、碳源、氮源等培養條件不全相同造成的。囊狀匍柄霉新疆菌株的最適溫度生長為25℃，這與陸訓[23]對引起萵苣葉斑病的囊狀匍柄霉研究結果一致；光照對其無顯著影響，說明囊狀匍柄霉對光照的需求不嚴格，這與張志強[24]對引起大蒜葉枯病的囊狀匍柄霉研究結果一致。溫度升至30℃時，2種病原菌菌絲生長緩慢，35℃時，苜蓿莖點霉的菌絲不再生長而囊狀匍柄霉的菌絲仍可緩慢生長，苜蓿莖點霉對高溫的忍耐力弱于囊狀匍柄霉，這與7月以后調查采樣時未發現苜蓿莖點霉葉斑病而正是苜蓿匍柄霉葉斑高發期相吻合。氮源硫酸銨對苜蓿莖點霉抑制作用顯著，磷酸二氫銨對囊狀匍柄霉抑制作用顯著，根據這一結果下一步可以考慮在生產中通過適量增施硫酸銨和磷酸二氫銨，研究其對這2種病害的抗性效應。

4 結 論

2種病原菌在不同培養基、溫度、碳氮源下均具有一定的適生性。苜蓿莖點霉(代表菌株PM-1)的最適溫度、培養基、碳氮源分別為25℃、GPA和PSA培養基、麥芽糖和L-谷氨酰胺，致死溫度為55℃，24 h持續光照有利于該菌生長。囊狀匍柄霉(代表菌株SV-1)的最適溫度、培養基、碳氮源分別為25℃、GPA培養基、菊糖和L-谷氨酰胺，致死溫度為60℃，不同光照處理對該菌絲生長差異不顯著。