葉黃素對人肺癌H1975細胞增殖和轉移的抑制作用及Hippo信號通路的影響

楊謙，楊蒙蒙，張軍，譚雪敏，馬玉泉

肺癌是我國的主要健康問題，約占所有癌癥相關死亡人數的28%[1]。肺癌的2種主要形式是小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，分別占15%和85%[2]。常規治療和手術方法難以控制肺癌，導致預后不良，NSCLC的總體5年生存率僅為15%。顯然，有必要對NSCLC的替代治療方案進行研究，有望減輕這一主要的死亡負擔[3]。Hippo通路的失調和肺癌發展有關，并有助于肺癌細胞的發展和轉移[4]。鈣黏蛋白4(FAT4)可以作為Hippo通路調節劑來抑制癌細胞的生長和侵襲，并且在24%的肺癌患者中發生突變[5]。FAT4是一種腫瘤抑制因子，可誘導細胞死亡，FAT4的抑制導致Yes結合蛋白(YAP)激活，從而誘導YAP靶基因的上調[6]。葉黃素(3,3-二羥基-α-胡蘿卜素)又稱“植物葉黃素”，是一種氧化的類胡蘿卜素，在自然界廣泛存在，可以從萬壽菊中提取。大量的流行病學證據表明，葉黃素在預防動脈粥樣硬化和與年齡有關的黃斑變性，增強免疫系統及作為抗腫瘤藥方面具有多種功能[7]。本研究擬探討葉黃素對人肺癌H1975細胞增殖和轉移的抑制作用及Hippo信號通路的影響，為肺癌的治療提供理論依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及儀器 (1) 主要藥品、試劑:葉黃素(純度99.95%)、5-氟尿嘧啶(純度99.99%)(美國sigma公司)；RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；細胞計數試劑盒-8(CCK-8)、NP-40裂解緩沖液、結晶紫染液(碧云天生物技術研究所)；Matrigel小室(美國BD公司)；膜聯蛋白V-PE凋亡檢測試劑盒、核糖核酸酶(RNase)、碘化丙啶(PI)染色液(上海群己生物科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTM RT)(寶日醫生物技術北京有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(賽默飛世爾科技中國有限公司)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、硝酸纖維素膜(德國默克公司)；FAT4、YAP、β-actin一抗(美國Abcam公司)；HRP標記山羊抗兔IgG二抗(上海研卉生物科技有限公司)；SuperSignal West Pico化學發光底物試驗試劑盒(美國Pierce公司)。(2)主要儀器：UV1901型紫外分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)；IX71型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)；ABI 7900HT型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 細胞培養及分組 實驗于2019年8—9月在邯鄲市中心醫院實驗室進行。人肺癌H1975細胞系購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，批號S2019061703。將細胞置于10%FBS和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養，培養環境為37℃、5%CO2、2% O2、93%N2。分組設計：H1975細胞組，將H1975細胞在含有10% FBS的RPMI-1640培養基中培養，培養環境為37℃、5%CO2、2% O2、93%N2；5-氟尿嘧啶組，H1975細胞培養方法同H1975細胞組，加入5-氟尿嘧啶，使5-氟尿嘧啶劑量為100.0 μg/ml(預試驗求得5-氟尿嘧啶對H1975細胞的LC50為200.0 μg/ml，以1/2 LC50為作用劑量)；葉黃素低、高劑量組的H1975細胞培養方法同H1975細胞組，各組分別加入葉黃素，使葉黃素劑量為100.0 μg/ml、200.0 μg/ml(預試驗求得葉黃素對H1975細胞的LC50為400.0μg/ml，以1/4、1/2 LC50為低、高劑量)。以上各組每孔設6個平行樣，培養72 h。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 細胞存活率及克隆形成數目測定：使用CCK-8試劑評估細胞存活率。將細胞以1×103個/孔的密度接種到96孔板的100 μl培養基中，將100 μl CCK-8試劑添加到培養物中。然后用紫外分光光度計在450 nm下測量OD值。細胞存活率=實驗組OD/空白組OD×100%。空白組為蒸餾水調零組。

將細胞以800個/孔的濃度接種到6孔板中72 h。然后，每3天用含有10%FBS的培養基更新培養基一次，觀察到單克隆形成。計數具有40個以上細胞的單克隆，應用結晶紫染色，并使用顯微鏡拍攝代表性照片。

1.3.2 細胞侵襲、轉移水平測定：進行Matrigel小室侵襲測定，將1×104個細胞添加到包被Matrigel小室(孔徑為8 μm微孔)的上腔室中。將含有10%FBS的600 μl培養基添加到下腔室中。固定細胞并在72 h后分別用0.05%的結晶紫染色。使用顯微鏡以200倍放大率拍攝每個腔室的6個隨機視野。

1.3.3 細胞凋亡水平測定：使用膜聯蛋白V-PE凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。收獲預處理的細胞，在4℃的冰冷70%乙醇中固定過夜，然后重懸于1 ml含1 mg/ml RNase和50 μg/ml PI的磷酸緩沖液，并在暗盒中于室溫放置30 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。通過計數右上象限Annexin-V陽性—PI陽性細胞的比例，即為凋亡率。

1.3.4 細胞FAT4、YAP基因表達測定：通過Trizol試劑從細胞中提取總RNA。RNA的純度和濃度通過紫外分光光度計測量。用PrimeScriptTM RT試劑盒進行逆轉錄。反應條件為37℃ 15 min逆轉錄，85℃ 5 s逆轉錄酶滅活。獲得的cDNA在-80℃保存。引物由寶日醫生物技術北京有限公司合成，序列如下，FAT4正向：5′-CTGTGAGTACCTGTGACTGGTGTGACCCTGT-3′，反向：5'-GTGTCTGTGTGGAVCTGAAGTGAC-3'；YAP正向：5'-CTGTGACTACCCGTCTGCCTGTGA-3'，反向：5'-CTGTGACTGCGGCGAGTGCTGA-3'；β-actin正向：5'-CTGTGACTGACCGTCTACTGTGAC-3'，反向：5'-CCGTGTGACGTCGGCGACGTGTGAC-3'。β-actin作為內參基因。在ABI 7900HT型熒光定量PCR儀進行PCR反應。反應條件如下：在95℃預變性30 s，在95℃下變性40 s，在58℃下退火30 s。通過2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達量。

1.3.5 細胞FAT4、YAP蛋白水平測定：NP-40裂解緩沖液提取總蛋白，并通過BCA蛋白濃度測定試劑盒進行定量。用12%SDS-PAGE電泳分離出每個樣品中的蛋白質(50 μg)，并將其電印跡到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%牛奶封閉1 h后，將膜與FAT4(1∶2 000稀釋)、YAP(1∶2 000稀釋)、β-actin(1∶2 000稀釋)一抗、HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)在4℃孵育過夜。使用Super Signal West Pico化學發光底物試驗試劑盒可視化標記有抗體的蛋白條帶。使用Chemi Doc XRS系統獲取圖像，使用Band Scan 5.0版軟件分析蛋白質表達。

2 結 果

2.1 各組肺癌H1975細胞OD值、存活率比較 與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組OD值、存活率均降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組OD值、存活率升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組OD值、存活率降低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組肺癌H1975細胞克隆形成數目比較 與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組克隆形成數目降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組克隆形成數目升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組克隆形成數目降低(P<0.05)，見表2、圖1。

表1 各組肺癌H1975細胞OD值、存活率比較

表2 各組肺癌H1975細胞克隆形成數目比較個)

2.3 各組肺癌H1975細胞穿膜數比較 與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組穿膜數降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組穿膜數升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組穿膜數降低(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 各組肺癌H1975細胞穿膜數比較個)

AH1975細胞組 5-氟尿嘧啶組 葉黃素低劑量組 葉黃素高劑量組

H1975細胞組 5-氟尿嘧啶組 葉黃素低劑量組 葉黃素高劑量組

2.4 各組肺癌H1975細胞凋亡率比較 與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組凋亡率升高(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組凋亡率降低(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組凋亡率升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組肺癌H1975細胞凋亡率比較

2.5 各組肺癌H1975細胞FAT4、YAP mRNA表達比較 與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組FAT4 mRNA表達水平升高，YAP mRNA表達水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組FAT4 mRNA表達水平降低，YAP mRNA表達水平升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組FAT4 mRNA表達水平升高，YAP mRNA表達水平降低(P<0.05)，見表5。

表5 各組肺癌H1975細胞FAT4、YAP mRNA表達比較

2.6 各組肺癌H1975細胞FAT4、YAP蛋白表達比較 與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組FAT4 蛋白表達水平升高，YAP蛋白表達水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，葉黃素低、高劑量組FAT4蛋白表達水平降低，YAP蛋白表達水平升高(P<0.05)；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組FAT4蛋白表達水平升高，YAP蛋白表達水平降低(P<0.05)，見表6、圖3。

表6 各組肺癌H1975細胞FAT4、YAP蛋白表達比較

注：A.H1975細胞組；B.5-氟尿嘧啶組；

3 討 論

肺癌是全球范圍內與癌癥相關死亡的主要原因，男性吸煙者的發病率為17.2%，女性吸煙者的發病率為11.6%，而非吸煙者分別為1.3%和1.4%[8]。肺癌以NSCLC為主，包括腺癌、鱗癌、腺鱗癌和大細胞肺癌。盡管在過去的幾十年中，人們一直在努力開發針對NSCLC的新療法，包括化學療法和分子靶向療法，但對于轉移性NSCLC患者，其5年生存率仍低于5%[9]。葉黃素是一種含氧的類胡蘿卜素，在自然界廣泛存在。葉黃素存在于許多有色水果(石榴、漿果和深色葡萄)和蔬菜(茄子、西紅柿、胡蘿卜和紅洋蔥)中，具有抗氧化劑、抗炎、抗增殖和抗癌活性。葉黃素在炎性反應、心血管疾病、年齡相關性黃斑變性及癌癥中的有益作用已被探索[10]。研究已經證明，葉黃素對冠心病患者具有抗炎性反應作用，葉黃素可抑制PDGF和H2O2信號傳導，并抑制血管平滑肌細胞的遷移[11]。葉黃素是一種多目標治療性天然藥物，可阻斷RTK活性及EGFR、VEGFR2的下游信號傳導，以提高治療癌癥效果并將對正常宿主細胞的毒性降至最低[12]。本研究結果顯示，與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、葉黃素低劑量組、葉黃素高劑量組OD值、存活率、克隆形成數目、穿膜數均降低，凋亡率升高；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組OD值、存活率、克隆形成數目、穿膜數降低，凋亡率升高。說明葉黃素能明顯抑制人肺癌細胞H1975增殖及轉移，且葉黃素高劑量組抑制人肺癌細胞H1975增殖及轉移更顯著。

Hippo信號通路是一種腫瘤抑制通路，它通過抑制細胞生長和增殖并促進細胞凋亡來調節器官的大小。該途徑主要由核心抑制激酶級聯反應組成，包括MST1/2和LATS1/2，這些成分會磷酸化轉錄共激活因子YAP。一旦被激活，YAP就會轉移到細胞核中，并與TEAD1-4相互作用以激活Hippo信號通路的下游靶標，從而促進細胞過度生長和轉移[13]。FAT4是鈣黏著蛋白超家族的鈣黏著蛋白相關蛋白，是Hippo信號的調節劑和抑癌劑，可抑制癌細胞的生長[14]。FAT4在肺癌中下調，并在各種人類癌癥中反復突變，涉及肝細胞癌和胃癌[15]。FAT4是Hippo生長控制途徑的重要組成部分，在39%的腫瘤中被甲基化[16]。FAT1和FAT4通過激活與lamellipodia和filopodia上的肌動蛋白聚合相關的Hippo信號傳導來抑制腫瘤生長。FAT4也被指出可誘導YAP易位，YAP易位于胃癌的細胞增殖和遷移[17-19]。本研究結果顯示，與H1975細胞組比較，5-氟尿嘧啶組及葉黃素低、高劑量組FAT4 mRNA和蛋白表達水平升高，YAP mRNA和蛋白表達水平降低；與葉黃素低劑量組比較，葉黃素高劑量組FAT4 mRNA和蛋白表達水平升高，YAP mRNA和蛋白表達水平降低。這與上述討論一致，同時說明，葉黃素可促進FAT4 mRNA和蛋白的表達，抑制YAP mRNA和蛋白表達進而抑制Hippo通路。近期，許多研究報道了肺癌中Hippo信號的失活與腫瘤的發生和發展有關。這種失活也被證明會導致Hippo通路下游基因如CTGF、CYR61、FOXM1和CDX2的上調，而這些基因是否會在肺癌中改變，將在后續研究中進行證實。

綜上所述，葉黃素能明顯抑制人肺癌細胞H1975增殖及轉移；其機制與葉黃素可促進FAT4 mRNA和蛋白表達、抑制YAP mRNA和蛋白表達進而抑制Hippo通路有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊謙：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；楊蒙蒙：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；張軍：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；譚雪敏：進行統計學分析；馬玉泉：課題設計，論文撰寫