CSN6對宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞自噬能力的影響研究

李想 于思琪 李彤

摘要：目的 ?探討組成型光形態發生因子9信號復合體亞基6（CSN6）對宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞自噬能力的影響。方法 ?購置宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞，并測定腺病毒中GFP與mRFP表達水平，標記、追蹤LC3，示蹤自噬流的水平;將購置的細胞放置在6孔板中進行培養，隨機分為對照序列組、CSN6 siRNA組、空載體質粒組與CSN6過表達組，各組細胞均進行相應的處理（連續完成24 h干預）;采用Western Blot法測定各組細胞中CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平，熒光顯微鏡下檢測兩種細胞中自噬體個數，采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測各組細胞干預后增殖抑制率。結果 ?siCSN6組不同宮頸癌細胞中自噬體個數高于siCtrl組，差異具有統計學意義（P<0.05）;siCSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異具有統計學意義（P<0.05）;CSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平低于siCtrl組、siCSN6組，差異具有統計學意義（P<0.05）;siCSN6組干預后2、6、12、24、48 h細胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 ?轉染CSN6能提高宮頸細胞的自噬水平，而過表達CSN6則能抑制自噬活性，均會對細胞增殖抑制率產生影響。

關鍵詞：組成型光形態發生因子9信號復合體亞基6;宮頸癌;自噬能力;增殖抑制率

中圖分類號：R737.33 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.17.021

文章編號：1006-1959（2020）17-0073-04

Abstract：Objective ?To investigate the effect of constitutive photomorphogenetic factor 9 signaling complex subunit 6 （CSN6） on the autophagy ability of cervical cancer HeLa cells and SiHa cells.Methods ?Purchasing cervical cancer HeLa cells and SiHa cells， and determining the expression levels of GFP and mRFP in adenovirus， labeling and tracking LC3， and tracing the level of autophagic flux; the purchased cells were placed in a 6-well plate for culture and randomly divided into control sequence group， CSN6 siRNA group， empty vector plasmid group and CSN6 overexpression group. Cells in each group were treated accordingly （continuously completed 24 h intervention）; Western Blot method was used to determine the CSN6， LC3 protein，the expression levels of Beclin1 and Atg5， the number of autophagosomes in the two types of cells were detected under a fluorescence microscope， and the proliferation inhibition rate of each group of cells after intervention was detected by the tetramethylazazole blue （MTT） method. Results ?The number of autophagosomes in different cervical cancer cells in the siCSN6 group was higher than that in the siCtrl group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression levels of CSN6， LC3 protein， Beclin1， Atg5 in the siCSN6 group were higher than those in the siCtrl group， siCSN6 group and CSN6 group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression levels of CSN6， LC3 protein， Beclin1， Atg5 in the CSN6 group were lower than those in the siCtrl and siCSN6 groups，the difference was statistically significant （P<0.05）;The cell proliferation inhibition rate in the siCSN6 group was higher than that in the siCtrl group， siCSN6 group and CSN6 group at 2， 6， 12， 24， and 48 h after intervention，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion ?Transfection of CSN6 could increase the autophagy level of cervical cells， while overexpression of CSN6 could inhibit the autophagy activity， both of which would affect the cell proliferation inhibition rate.

Key words：Constitutive photomorphogenetic factor 9 signaling complex subunit 6;Cervical cancer; Autophagy;Proliferation inhibition rate

宮頸癌（cervical cancer）是臨床上發生率較高的女性惡性腫瘤，好發于30～55歲人群中，常見病因包括[1]HPV感染、多性伴侶、多孕多產、單純皰疹病毒Ⅱ型感染等。患者發病早期臨床癥狀缺乏典型性，隨著病情的不斷發展，會出現陰道流血、排液等，影響患者健康、生活。自噬在細胞中較為常見，能通過自身的溶酶體等將受損的細胞器/大分子進行溶解，以適應惡劣的生存環境[2，3]。研究表明[4]，自噬在機體中多處于平衡狀態，當自噬發生異常后則會誘發腫瘤的發生。近年來，隨著醫療技術的不斷發展，臨床對于自噬研究不斷深入，發現自噬在腫瘤的發生、發展中能發揮雙重作用[5，6]。組成型光形態發生因子9信號復合體亞基6（CSN6）屬于是CSN的關鍵亞基，且在多種惡性腫瘤中表達水平較高。同時，CSN能與E3泛素連接酶相互作用，從而完成腫瘤細胞增殖、轉移及凋亡的調節，但是對于宮頸癌細胞自噬的影響研究較少[7，8]。因此，本研究以宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞為對象，探討CSN6對宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞自噬能力的影響，報道如下。

1材料與方法

1.1材料來源 ?2018年8月～2019年6月購置宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞作為對象，所有細胞均源于中國上海中科院生物研究所。

1.2儀器與設備 ?本實驗主要儀器及設備及廠家情況見表1。

1.3方法

1.3.1 細胞的培養、復蘇及處理 ?將購置的宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞從液氮中取出，37 ℃恒溫水浴鍋中手動搖晃（加快細胞溶解），待2/3體積的凍存液溶解;超凈工作臺上打開封口膜，放入完全培養液10 ml的離心管中，5 min離心，速度1000 rpm;去除上清，采用DMEM完全培養液5 ml完成細胞沉淀重懸，利用適當力度吹打細胞，混合后將其放置在細胞培養瓶中。標記相應細胞的類型、處理時間后，經酒精消毒后放置在細胞培養箱內進行培養（5%CO2、溫度37 ℃）。倒置顯微鏡下觀察細胞形態、是否獲得良好貼壁，當培養液變黃后完成細胞首次全量換液（換液前采用PBS緩沖液完成3次清洗），加入濃度為10.0%的PBS新鮮培養基繼續培養，待細胞融合瓶底80.0%以上后完成細胞傳代培養。取傳代后的細胞，離心完畢后去除上清，根據實驗所需，調整細胞密度，備用[9，10]。

1.3.2自噬雙標腺病毒示蹤自噬流 ?采用單體紅色熒光蛋白耦合到綠色熒光蛋白-LC3（mRFP-GFP-L3）串聯熒光蛋白腺病毒中表達的GFP與mRFP，并標記、追蹤LC3，示蹤自噬流的水平。CFP減弱能指示溶酶體與自噬小體融合形成自噬溶酶體，在顯微鏡下對于細胞中存在黃色斑點即為自噬體。采用自噬雙標腺病毒完成HeLa細胞與SiHa細胞的轉染（每2 h換液1次），連續進行24 h干預，熒光顯微鏡下每孔取視野5個，觀察mRFP-GFP-LC3熒光斑點數量[11]。

1.3.3細胞分組與處理 ?取上述處理后的宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞，將其放置在6孔板中進行培養，隨機分為對照序列組（siCtrl組）、CSN6 siRNA組（siCSN6組）、空載體質粒組（Vector組）與CSN6過表達組（CSN6組），各組細胞均進行相應的處理（連續完成24 h干預）。采用slLent-Fect轉染試劑向siCtrl組完成陰性對照序列助燃，siCSN6組轉染CSN6 siRNA，各組細胞均連續完成24h干預。同時，采用Roche轉染試劑轉染Vector組細胞[pcDNA3.1（+）-空載體質粒];采用pcDNA3.1（+）-CSN6過表達，轉染CSN6組細胞，各組細胞均連續完成24 h干預，熒光顯微鏡下檢測不同細胞中自噬體個數。

1.3.4自噬相關基因蛋白水平 ?取各組干預后的細胞，加入蛋白裂解液200 μl，30 min裂解，溫度4 ℃，10 min離心，速度為12000 rpm，離心半徑為5.5 cm，上述操作完畢后將獲得的上清移到高壓消毒的EP管中。根據相關說明采用Western Blot法測定各組細胞中CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平。請各組樣品40 μg完成SDS-PAGE電泳，轉膜到聚篇二氟乙烯（PVDF）膜，并利用濃度為5%胎牛血清白蛋白（BSA）完成1 h封閉。同時，根據蛋白分子量完成條帶切割，分別加入CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5蛋白一抗，常溫下完成2h孵育，經洗膜、顯色、顯影等操作后拍照[12]。

1.3.5細胞增殖抑制率 ?采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測各組細胞干預后增殖抑制率，取四組處理后的細胞，根據5×103個接種在96孔培養板中，待細胞貼壁后分別加入不同濃度的、新鮮配置的ASP培養基200 μl（濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L），各組均連續完成48 h培養，設置陰性對照組（加入等體積不含有ASP的培養基）。向每孔中加入MMT液20 μl，濃度為5 mg/ml，連續完成4 h孵育，去除上層清液，向每孔中加入DMSO液150 μl，搖床上連續完成10 min干預。在酶標儀492 nm下完成吸光度值A值測定，根據公式計算細胞增殖率（%）[抑制率=1-A測定細胞/A陰性對照組]×100.00%[13]。

1.4統計學分析 ?采用SPSS 18.0軟件處理數據，計數資料采用[n（%）]表示，行？字2檢驗，計量資料采用（x±s）表示，行t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1不同細胞中自噬體個數比較 ?熒光顯微鏡下完成宮頸癌HeLa細胞與SiHa細胞中mRFP-GFP-LC3熒光斑點數量，siCSN6組不同宮頸癌細胞中自噬體個數高于siCtrl組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2四組自噬相關基因蛋白水平比較 ?siCSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異有統計學意義（P<0.05）;CSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平低于siCtrl組、siCSN6組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3四組細胞增殖抑制率比較 ?siCtrl組、siCSN6組不同時間點細胞增殖抑制率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;siCSN6組干預后2、6、12、24及48 h細胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異有統計學意義（P<0.05）;CSN6組不同時間點細胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

3討論

宮頸癌是女性發病率較高的生殖系統惡性腫瘤，由于患者發病早期臨床癥狀缺乏典型性，導致遠期預后較差。因此，積極研發宮頸癌新的治療方法、策略成為研究的熱點。細胞自噬是真核生物中進化保守的、對細胞內物質周圍較為重要的過程，該過程中損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，能進入溶酶體、液泡中進行降解并循環使用。臨床研究表明：細胞自噬過程是細胞成分分解、回收利用的重要基礎，多用于營養缺乏狀態下培養的細胞、植物的免疫反應、葉片衰老等。細胞自噬屬于較為重要的生物學現象，能直接參與生物的發育、生長等過程，當細胞自噬異常時則會出現癌細胞。本研究中，siCSN6組不同宮頸癌細胞中自噬體個數高于siCtrl組，差異有統計學意義（P<0.05），說明CSN轉染能改變細胞自噬體的數量，可能直接參與宮頸癌的發生、發展。CSN6屬于是CSN的關鍵亞基，在諸多惡性腫瘤中表達，與致癌活性相關，且臨床對于CSN6的研究更多的集中在調節E3泛素連接酶介導的癌癥相關蛋白泛素化水平，從而能調節腫瘤細胞的周期、增殖、轉移與凋亡，但是臨床對于腫瘤細胞自噬的機制尚未腸闡明。

CSN最初發現于南芥中光依賴性生長與轉錄的阻遏物，屬于是一種泛素-蛋白酶體調節劑。臨床研究表明：CSN主要由9個不同的亞基組成，在多種惡性腫瘤中呈高表達，其表達水平與腫瘤細胞的活性有關。多種腫瘤抑制因子、致癌因子均受到CSN的影響，并且CSN6亦可與E3泛素連接酶相互作用、結合，能同屆機體泛素化水平，從而在腫瘤周期的調節、腫瘤細胞的增殖與凋亡中發揮重要作用。本研究中，Western Blot法測定結果表明：siCSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組（P<0.05）;CSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達水平低于siCtrl組、siCSN6組（P<0.05），說明CSN6在宮頸癌細胞自噬的調節中發揮了重要的作用。既往研究表明：CSN6能提高SCF泛素連接酶的生物活性，能降解哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活性，從而能調節細胞自噬作用。CSN6已經證實在多種惡性腫瘤中呈高表達，與致癌活性有關，能與E3泛素連接酶及相關的靶蛋白結合，調節其泛素化水平。CSN6能增強SCF泛素連接酶的亞基Fbxw7的自我泛素化與降解。而Fbxw7能靶向降解哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），是調控自噬起始的關鍵復合物。國外學者研究表明：宮頸癌細胞中自噬活性水平降低與疾病的發生有關，有效的提高腫瘤細胞自噬活性，能為宮頸癌治療提供新的思路與方法。本研究中，siCSN6組干預后2、6、12、24及48 h細胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組（P<0.05），說明CSN6能提高宮頸癌細胞的姿勢能力，提高細胞的增殖抑制率，有望成為宮頸癌新的治療靶點。

總之，轉染CSN6能提高宮頸細胞的自噬水平，過表達CSN6能抑制自噬活性，均會對細胞增殖抑制率產生影響，能為宮頸癌治療提供新思路。

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收稿日期：2020-07-08;修回日期：2020-07-23

編輯/成森