豬乙型腦炎病毒SYBR-GreenⅠ實時熒光定量PCR方法的建立

常晨 張道華 唐波 劉國陽 華濤 王海燕

摘要：為建立豬乙型腦炎病毒（JEV）的定量檢測方法，根據(jù)E基因序列，設(shè)計1對特異性引物，建立檢測JEV的熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，該方法靈敏度達(dá)到103拷貝/μL，對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性;采用JEV攻毒小鼠，熒光定量PCR比普通PCR更能靈敏地檢出組織帶毒量。該方法可用于組織樣品中乙腦病毒的定量檢測以及臨床乙腦病毒感染的早期檢測和定量分析豬乙腦病毒感染程度。

關(guān)鍵詞：豬乙腦病病毒;SYBR-GreenⅠ;熒光定量PCR;檢測

中圖分類號： S852.65文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0081-05

收稿日期：2019-12-04

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2018YFD0500800）;公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201403051）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（17）3049]。

作者簡介：常?晨（1987—），女，江蘇南京人，碩士，助理研究員，主要從事動物疫苗產(chǎn)品研究工作。E-mail：346283525@qq.com。

通信作者：張道華，碩士，研究員，主要從事動物分子病原學(xué)及免疫學(xué)研究。E-mail：zhangdh2005@163.com。

日本流行性乙型腦炎（乙腦，Japanese encephalitis，JE）是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種人畜共患傳染病。乙型腦炎病毒主要通過攜帶病毒的蚊蟲叮咬傳播，庫蚊、伊蚊和按蚊是JEV的主要傳播媒介，豬是主要貯存宿主及擴散宿主，JE主要發(fā)生于夏秋季節(jié)。豬乙腦病常引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎，公豬睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱，新生仔豬神經(jīng)癥狀，對養(yǎng)殖業(yè)安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅[1-2]。對豬進(jìn)行疫苗免疫能有效減少JEV對養(yǎng)豬業(yè)造成的危害，進(jìn)行及時正確的診斷是預(yù)防和控制該病的關(guān)鍵[3]。

診斷豬乙型腦炎的病原學(xué)方法有病毒分離鑒定、RT-PCR檢測、熒光定量RT-PCR、熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增（RT-LAMP）、基因芯片技術(shù)等[4]。孫靜等曾報道，采用RT-PCR方法檢測JEV，雖靈敏且能在疾病早期對病毒進(jìn)行檢測，但由于分析步驟繁瑣且容易造成污染，所以使用受到限制[5]。熒光定量RT-PCR方法操作簡便、靈敏度高、特異性好，熒光染料SYBR-GreenⅠ熒光信號的積累與擴增的雙鏈DNA數(shù)量呈正相關(guān)，該方法成本較探針法低，且可達(dá)到快速、定量的目的，對疾病的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防起著重要的作用[6]。

JEV為單股正鏈RNA病毒，E基因是乙腦病毒毒力基因，E蛋白為該病毒的主要表面結(jié)構(gòu)蛋白，存在大量的中和抗原表位，是病毒重要的抗原決定簇[7]。本研究以E基因序列作為靶序列設(shè)計1對引物，利用SYBR-GreenⅠ熒光染料定量PCR方法，定量檢測組織中的病毒含量，對診斷乙腦早期感染和對病毒凈化有重要意義。

1?材料與方法

1.1?毒株與試驗動物

JEV J3株、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV），由筆者所在實驗室分離與保存;1周齡無特定病原體（SPF）級BALB/c小鼠，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

1.2?主要試劑與儀器

RNA iso Reagent試劑盒、DL 2000 Marker、Ex TaqTM、SYBR Premix Ex TaqTM 、pMD18-T載體、凝膠回收試劑盒、載體連接試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自寶生物工程（大連）有限公司;Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀，購自美國Gene公司。

1.3?引物設(shè)計與合成

根據(jù)Gen Bank中JEV的E基因序列設(shè)計獲得重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品引物，即上游引物：5′-TTGGTCGCTCCGGCTTACAG-3′;下游引物：5′-GCCACTTCCACACCTCATCT-3′，目的片段大小為1 574 bp。設(shè)計獲得熒光定量PCR上下游引物，即上游引物：5′-AGAGCGGGGAAAAAGGTC-3′;下游引物：5′-TTTCACGCTCTTTCTACAGT-3′，目的片段大小為 162 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4?質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取JEV J3株病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過PCR擴增獲得乙腦E基因片段，PCR運行程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 min，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段采用凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物連接至 pMD-18T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。提取獲得重組質(zhì)粒后，進(jìn)行酶切鑒定。將酶切大小正確的重組質(zhì)粒送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將經(jīng)測序驗證的陽性質(zhì)粒作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，命名為pMD-JEV-E。

1.5?SYBR-GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用紫外分光光度計測量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-JEV-E的吸光度，并計算拷貝數(shù)，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴增，得到動力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR擴增體系為20 μL反應(yīng)體系，其中上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），SYBR Premix Ex TaqTM 10.0 μL，模板2.0 μL，滅菌去離子水7.2 μL。反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.6?重復(fù)性檢驗

選取乙腦病毒同一濃度的質(zhì)粒進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)，每個樣品做3個重復(fù)，通過CT值和溶解曲線峰值溫度分析驗證JEV SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

1.7?特異性檢驗

提取JEV、CSFV病毒液總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。提取PRV、PPV、PCV2病毒液DNA，按照SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系檢測上述病毒核酸，同時設(shè)置陰性對照組，驗證本研究方法特異性。

1.8?敏感性檢驗

對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，將稀釋為 1～108拷貝/μL 的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴增，分析本研究方法檢出的最低拷貝數(shù)。

1.9?對免疫攻毒小鼠腦組織的檢測

選取SPF級BALB/c小鼠10只，乙腦滅活苗免疫小鼠5只，同時設(shè)空白小鼠5只，6 d后加免，9 d后進(jìn)行腹腔攻毒，JEV J3株F3代100 LD50 （100倍半數(shù)致死量）0.2 mL/只，同時對小鼠進(jìn)行腦部空刺，攻毒后每日觀察，取瀕死小鼠的腦部組織，研磨、提取組織RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過本研究方法和普通PCR進(jìn)行檢測。

2?結(jié)果與分析

2.1?JEV E基因PCR擴增與測序

由圖1可知，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物在1 000～2 000 bp之間，測序得片段大小為 1 574 bp，與預(yù)計的片段大小相符。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取合適濃度范圍（104～109拷貝/μL）的質(zhì)粒進(jìn)行熒光PCR，并通過LightCycler 480進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣品在該范圍內(nèi)具有良好的擴增曲線（圖2）。由圖3可知，倍比稀釋質(zhì)粒樣品在此濃度范圍內(nèi)具有良好的擴增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距為41.24，斜率為-3.761，擴增效率為99.5%，誤差為0.019 5，判定系數(shù)R2為0.99。

2.3?重復(fù)性檢測

為驗證熒光定量PCR檢測結(jié)果的可重復(fù)性，對每個稀釋度（104～109拷貝/μL）重組質(zhì)粒樣品設(shè)3個重復(fù)進(jìn)行檢測試驗，由圖4可知，3次重復(fù)的動力學(xué)曲線重合，可見熒光定量PCR有很高的可重復(fù)性。

2.4?特異性檢測

對豬病毒JEV、PRV、CSFV、PPV、PCV2的核酸及雙蒸水進(jìn)行熒光定量PCR檢測，由圖5可知，JEV在5個循環(huán)左右開始起峰，而其他病毒及雙蒸水均在35個循環(huán)后起峰，均為非特異性起峰，表明該方法具有良好的特異性。

2.5?敏感性檢測

將10倍梯度稀釋后的質(zhì)粒（100～108拷貝/μL）作為模板，采用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。由圖6可知，當(dāng)模板濃度為 103拷貝/μL 時，檢測結(jié)果仍為有規(guī)律的S型熒光曲線。說明本研究方法的最低檢測限為103拷貝/μL。

2.6?對免疫攻毒小鼠腦組織的檢測

由表1、表2可知，采用本研究方法檢測到對照組攻毒小鼠的腦組織中乙腦病毒結(jié)果均為陽性，且可計算出組織中的病毒載量，免疫組攻毒小鼠僅1只檢測結(jié)果呈陽性，而PCR檢測僅部分結(jié)果呈陽性，且無法計算出組織中的病毒載量。

3?討論

乙型腦炎是人獸共患病，且自然界中大部分脊椎動物均是乙型腦炎病毒易感宿主，提高乙腦病毒檢測的質(zhì)量和效率對乙腦病毒的發(fā)現(xiàn)和預(yù)防有重要作用。乙腦病毒感染至產(chǎn)生抗體存在一定的“窗

口期”，故抗體檢測不利于乙腦的早期診斷[8]。病毒分離與鑒定操作繁瑣、耗時多、靈敏度不高，不能實現(xiàn)乙腦病毒的快速檢測，RT-PCR可獲得很好的檢測效果，但不能對病原定量分析。劉衛(wèi)濱等根據(jù)JEV NS5基因[9]、霍紅等根據(jù)E基因分別設(shè)計引物與探針[10]，建立了TaqMan熒光定量RT-PCR方法，通過該方法檢測豬血清樣品的靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，但其成本高，需結(jié)合特異性探針。韓國學(xué)者Jeong等利用熒光染料SYBR Green Ⅰ構(gòu)建實時熒光PCR檢測JEV方法，將擴增區(qū)段選定在3′端非編碼區(qū)（共323 bp），該區(qū)段的GC含量高并存在連續(xù)的G或C，且3′端非編碼區(qū)在病毒基因組中能夠形成一定的空間結(jié)構(gòu)，不利于逆轉(zhuǎn)錄過程引物的退火與cDNA合成過程，所以本研究未將3′端非編碼區(qū)作為擴增檢測分析目的區(qū)段[10]。本研究根據(jù)JEV E基因片段保守序列，設(shè)計合成熒光定量PCR上下游引物，結(jié)果顯示，本研究方法不僅呈現(xiàn)良好的特異性，檢測靈敏度也達(dá)到103拷貝/μL，與常規(guī)的PCR方法相比，該方法更精確、更省時、操作更簡便。本試驗建立了SYBR-Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法，選取豬乙型腦炎病毒E基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測結(jié)果為良好的S型熒光曲線，且具有很好的重復(fù)性，能夠靈敏地檢測出病毒感染的情況。

為了更好地驗證本研究建立的熒光定量PCR方法的可操作性、靈敏性、實用性，利用該方法檢測攻毒保護(hù)試驗中小鼠腦組織的病毒載量，發(fā)現(xiàn)各稀釋質(zhì)粒樣品均具有良好的擴增曲線，根據(jù)CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線公式可精確計算出組織中的初始病毒量，與該方法相比，普通PCR方法有很多陽性漏檢。熒光定量PCR檢測不需要通過凝膠電泳檢測和測序分析，節(jié)約了試驗時間和成本。

本試驗建立的SYBR-Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法，有助于分析在乙腦的發(fā)病過程中JEV的動態(tài)變化與疾病發(fā)展的關(guān)系以及乙腦病毒感染的早期檢測和定量分析豬乙腦病毒感染程度。

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