新疆小麥籽粒過氧化物酶(POD)活性檢測及其基因等位變異檢測

王麗麗，戰帥帥，謝 磊，王繼慶，哈尼開·馬坎，任 毅，時 佳，耿洪偉

(新疆農業大學農學院/新疆農業大學生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】小麥是最重要的糧食作物之一[1-3]。品質已成為我國小麥主要育種目標，同時影響我國小麥產業競爭力[4]。面粉和面制品的顏色對小麥磨粉品質有重要影響[5]。面粉中蛋白質含量、氧化酶類活性以及色素類物質的積累對面粉及其制品的顏色有顯著影響[6-8]。過氧化物酶(POD, Peroxidase)是由多基因家族基因編碼的蛋白[2]，廣泛存在于所有生物體中，能氧化各種氫供體，如酚類物質、胺、抗壞血酸、吲哚和某些無機離子[9]。小麥籽粒中的POD活性對面粉色澤具有褐變和漂白的雙重作用，是影響面包、饅頭、面條白度的重要因素，POD活性高的小麥品種(系)面粉白度更高[10]。小麥籽粒過氧化物酶(POD，Peroxidase)活性對小麥加工品質和面粉色澤具有重要影響。研究小麥籽粒POD，對小麥面粉顏色及加工品質的改良具有重要意義。【前人研究進展】POD活性受遺傳因子、生態環境和栽培措施等影響，但主要受遺傳控制[11,12]。在禾本科作物中，普通小麥POD活性是燕麥、水稻和玉米的3～7倍[13]，且顯著高于(P<0.05)硬粒小麥[14-15]。在普通小麥的不同品種(系)間POD活性也可相差3～10倍[16-17]。通過遺傳途徑培育高POD活性品種(系)是可行的[18]。Rebordinos等[19]利用同源線性定位研究表明，普通小麥POD活性基因位于第3和第7同源染色體組上，尤其是第3同源染色體。Brenchley等[20]研究表明，POD基因類型多，分布廣，在A，B，D組中都有分布，Sareini等(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF525425)克隆了普通小麥籽粒中的Class Ⅲ型POD活性基因(WP1)的全長序列(AF525425)。魏景欣[3]選用豆麥/石 4185 RIL 群體結合90K的iSelect基因芯片進行POD活性基因定位，發現QPod.caas-3AL、QPod.caas-4BS和QPod.caas-5AS3個主效位點，基于效應值大的QPod.caas-3AL位點進行同源克隆，克隆了3A染色體POD基因TaPod-A1基因組DNA(gDNA)全長編碼序列并且開發了一對顯性互補功能標記POD-3A1/POD-3A2。時佳等[18]選用黃淮麥區材料151份與北部冬麥區82份品種(系)結合90K iSelect芯片對小麥品種(系)籽粒POD活性基因進行GWAS，發現2A、2D、5A、6A、7B和7D等多個穩定遺傳的位點，基于效應值大的7D位點進行同源克隆，克隆了7D染色體TaPod-D1基因gDNA全長編碼序列并且開發了一對顯性互補功能標記利用POD-7D1/POD-7D6。耿洪偉等[8]利用TaPod-A1位點功能標記POD-3A1/POD-3A2對129份新疆小麥品種(系)標記檢測發現，新疆小麥品種(系)以含有低POD活性相關的TaPod-A1a(的等位變異類型為主。謝磊等[21]利用TaPod-D1位點的功能標記POD-7D1/POD-7D6對98份新疆冬小麥品種(系)進行分子檢測顯示，新疆冬小麥品種(系)以含有低POD活性相關的TaPod-A1a的等位變異類型為主。【本研究切入點】雖然前人已有對新疆小麥POD活性相關基因等位變異分布情況的報道，但尚未有新疆小麥POD活性及新疆春小麥TaPod-D1基因的等位變異分布情況的報道。研究新疆小麥品種(系)過氧化物酶活性高低并分析相關基因變異類型和分布。【擬解決的關鍵問題】對113份新疆小麥品種(系)進行POD活性檢測，結合POD-3A1/POD-3A2和POD-7D1/POD-7D6分子標記結果，研究新疆小麥品種(系)TaPod-A1和TaPod-D1基因的等位變異分布頻率及其與POD活性之間的關系，驗證分子標記POD-3A1/POD-3A2和POD-7D1/POD-7D6的有效性，為利用分子標記選擇高POD活性小麥品種(系)和改良新疆小麥面粉品質奠定理論和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用113份新疆小麥品種(系)為供試材料，其中89份新疆冬小麥品種(系)和24份新疆春小麥品種(系)；冬小麥品種(系)包括16份地方品種(系)、34份引進品種(系)和39份自育品種(系)，春小麥品種(系)包括4份早期品種(系)(2000年前審定)和20份近期品種(系)(2000年后審定)。所有冬小麥材料均于2016～2017和2017～2018年2個年度播種于新疆農科院瑪納斯試驗站，隨機區組設計，2 m行長，每行120粒，行距20 cm，每個品種(系)種植3行，2次重復。田間管理與當地大田生產一致，成熟收獲后，人工脫粒。

1.2 方 法

1.2.1 POD活性檢測

稱取15 g去雜去劣的小麥籽粒采用配備0.8 mm篩子的旋風磨(瑞典LaboratoryMill 120)研磨成全麥粉放置于4℃待測。采用魏景欣等[3]方法，測定POD活性，2次重復，若2次檢測的結果相差超過10%，需重復檢測。單位POD活性(U)被定義為每克全麥粉每分鐘反應產物在470 nm處的吸光度增加0.01。

1.2.2 POD活性分子標記檢測

耿洪偉等[8]已對新疆冬小麥品種(系)進行TaPod-A1和TaPod-D1位點的等位變異檢測，謝磊等[21]也對新疆春小麥品種(系)進行了TaPod-D1位點的等位變異檢測，研究采用耿洪偉等[22]的方法，取3粒有代表性的種子提取基因組DNA，隨后利用時佳等[18]開發的功能標記POD-7D1/POD-7D6檢測24份新疆春小麥品種(系)，根據每個小麥品種(系)DNA標記結果判斷其基因型。表1

表1 用于檢測POD活性基因的分子標記及其引物序列

1.3 數據處理

用Excel進行數據統計和相關性分析，采用IBM SPSS statistics 21對數據進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同類型小麥的POD活性

研究表明，新疆小麥品種(系)的POD活性分布范圍很廣(730～4 600 U/(g·min))，最高、最低POD活性相差6倍，其POD平均活性為2 436.5 U/(g·min)，不同年份間POD活性相關系數為0.6(P<0.01)。新疆春小麥的POD活性(2 507.8 U/(g·min))高于新疆冬小麥的POD平均活性(2 417.2 U/(g·min))。在新疆冬小麥中，POD活性表現為引進品種(系)(活性為2 501.7 U/(g·min))>地方品種(系)(2 473.9 U/(g·min))>自育品種(系)(2 320.3 U/(g·min))；在新疆春小麥中，POD活性表現為近期品種(系)(2 524.0 U/(g·min))>早期品種(系)(2 426.9 U/(g·min))。表2

表2 不同類型新疆小麥品種(系)的POD活性

2.2 2個基因位點不同等位變異的POD活性

研究表明，在TaPod-A1位點，具有TaPod-A1b等位變異類型品種(系)的POD活性(2 595.3 U/(g·min))極顯著(P<0.01)高于具有TaPod-A1a等位變異類型品種(系)(2 346.0 U/(g·min))，TaPod-A1b為優異等位變異，在新疆冬小麥麥引進品種(系)和新疆春小麥早期品種(系)中2個等位變異類型的材料間POD活性均具有極顯著差異(P<0.01)；在TaPod-D1位點，具有TaPod-D1b等位變異類型品種(系)的POD活性(2 503.9 U/(g·min))顯著(P<0.05)高于具有TaPod-D1a等位變異類型品種(系)(2 376.9 U/(g·min))，在新疆冬小麥品種(系)中2個等位變異類型的材料間POD活性具有顯著差異(P<0.05)。TaPod-A1位點檢測與魏景欣[3]一致，可用于新疆小麥POD活性的輔助選擇，而TaPod-D1位點的檢測結果顯示TaPod-D1b為優異等位變異。表3

表3 不同類型小麥材料不同等位變異的POD活性

2.3 TaPod-A1和TaPod-D1位點等位變異組合與POD活性的關系

在檢測的113份新疆小麥材料中，TaPod-A1和TaPod-D1基因位點共存在TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1a/TaPod-D1b、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b四種等位變異組合類型。不同組合類型的總體分布比例表現不同。研究表明，2個高POD活性等位變異組合TaPod-A1b/TaPod-D1b(活性為2 706.2 U/(g·min))顯著高于由2個低POD活性的等位變異組合TaPod-A1a/TaPod-D1a(2 283.6 U/(g·min))，由一個高POD活性和一個低POD活性等位變異組合的TaPod-A1a/TaPod-D1b(2 408.4 U/(g·min))和TaPod-A1b/TaPod-D1a(2 516.8 U/(g·min))POD活性無顯著差異。將2個功能標記組合使用，可以提高優異等位基因的選擇效率。表4

表4 2個基因不同等位變異的POD活性

2.4 不同類型春小麥品種(系)中 TaPod-A1 和 TaPod-D1位點等位變異的分布頻率

研究表明，在TaPod-A1位點，新疆春小麥品種(系)中具有TaPod-A1b變異類型的材料有17份(占70.8%)，為優勢等位變異，其中早期品種(系)和近期品種(系)TaPod-A1b分布頻率分別為75.0%和70.0%，在TaPod-D1位點，具有TaPod-D1a在新疆春小麥品種(系)資源中有20份(83.3%)，為優勢等位變異，其中早期品種(系)和近期品種(系)TaPod-D1a分布頻率分別為100.0%和80.0%，無論是從新疆春小麥品種(系)的總體還是從早期或近期來看，均表現出TaPod-A1b和TaPod-D1a為優勢等位變異。在24份新疆春小麥材料中共有TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b3種等位變異，TaPod-A1b/TaPod-D1a在24份新疆小麥品種(系)、早期品種(系)或近期品種(系)分布頻率分別為54.2%、75.0%和50.0%，均表現為優勢等位變異。表5

表5 不同類型新疆春小麥材料不同等位變異的頻率

3 討 論

3.1 POD活性的測定

研究表明，新疆推廣種植的小麥品種(系)POD活性高，品種(系)間活性變異范圍大，其POD活性總體要高于全國3個主產麥區(北部冬麥區、黃淮麥區和長江流域與西南麥區)推廣的品種(系)[3]。從不同生產麥區來看，新疆小麥籽粒POD活性最低略高于中國北部冬麥區小麥品種(系)(729.36 U/(g·min))的活性，最高是長江流域與西南麥區的小麥品種(系)(653.38 U/(g·min))的7倍。主要是由氣候條件的差異造成的，新疆的干旱半干旱地區，年降雨量平均為117.8 mm，是我國典型的干旱少雨地區，還有諸如鹽漬化和高溫等非生物逆境脅迫，更易引起品種(系)的POD活性增高[23-26]。相比于其他麥區，新疆小麥品種(系)與中國北部冬麥區的小麥品種(系)籽粒POD活性最為接近，這主要是由于北部冬麥區與新疆緯度相近，寒、旱等自然條件也更為相近[27-28]。從新疆不同類型小麥的POD活性來看，新疆春小麥POD平均活性(2 507.8 U/(g·min))高于新疆冬小麥的POD平均活性(2 417.2 U/(g·min))。相吉山等[29]和桑偉等[30]通過對新疆小麥品種(系)資源籽粒性狀和磨粉品質的研究，發現新疆春小麥品種(系)的蛋白質含量往往比冬小麥高，作為籽粒蛋白質組成部分的POD含量也相應提高[31]，從而導致春小麥POD活性的偏高[32]，因此，新疆春小麥品種(系)有助于高POD活性品種(系)的遺傳改良。在新疆冬小麥品種(系)中，引進品種(系)POD活性顯著高于自育品種(系)和地方品種(系)，因此,引進品種(系)是新疆小麥面粉品質遺傳改良的重要途徑，在新疆小麥育種工作中應通過積極引進外地品種(系)，來改善新疆小麥的面粉品質。在新疆春小麥中，近期品種(系)POD活性高于早期品種(系)，除了消費者對小麥品質越來越高的關注和需求之外[33]，也源于新疆小麥育種近年來比較注重對面粉色澤的選擇[34-35]，使有利于提高小麥面粉白度的高POD活性基因得以在近期品種(系)中被保留。

3.2 POD活性相關基因TaPod-A1和TaPod-D1分子檢測結果

新疆小麥品種(系)在TaPod-A1和TaPod-D1 2基因位點，均以含有低POD活性相關的TaPod-A1a(63.7%)和TaPod-D1a(53.1%)的等位變異類型為主，這2種等位變異類型在均高于新疆小麥品種(系)中的分布頻率高于全國冬小麥品種(系)。而與高POD活性相關的優異等位變異組合TaPod-A1b/TaPod-D1b在新疆冬、春小麥品種(系)中分布頻率均較低，分別只有14.6%和15.0%。趙廣才等[36]研究表明，我國小麥品質研究起步較晚，前期更多的關注于產量性狀，忽視了品質的遺傳改良，而品質與產量存在一定負相關[37]，在進行高產選擇的同時，不經意間使非優異等位變異類型在選育過程中得到了積累。優異等位變異組合TaPod-A1b/TaPod-D1b在新疆冬小麥材料分布頻率大小為引進品種(系)>自育品種(系)>地方品種(系)，而在新疆春小麥材料中的分布頻率為近期品種(系)>早期品種(系)。表明新疆地方品種(系)對新疆小麥的早期育種工作有較大影響，外來種質的引入使得小麥優異等位變異頻率得到提升；與此同時，近期品種和自育品種多為以地方品種或自育品種(系)和外引品種為親本所育，外來種質的引入有力地推進了小麥品質的遺傳改良。因此，在今后育種工作中，應積極引進國內外優質品質(系)，采用優異等位變異類型品種(系)為親本，對于提高新疆小麥品種(系)優異等位變異的頻率，進而加快新疆小麥品質的遺傳改良是可行的。

3.3 POD活性相關分子標記的實用性

功能標記以其準確、高效、簡單的特點而大規模應用于作物育種[38]，功能標記的開發及應用逐漸稱為小麥分子育種的重要研究內容[39]。魏景欣等[3]和時佳等[18]研究表明，TaPod-D1b和TaPod-A1a基因型與低POD活性相關，TaPod-D1a和TaPod-A1b基因型與高POD活性相關。研究用TaPod-A1和TaPod-D1小麥POD活性基因的功能標記對新疆小麥品種(系)進行檢測，發現TaPod-A1等位變異和TaPod-D1均與POD活性呈極顯著正相關，其中具有TaPod-A1b等位變異材料的POD活性顯著高于具有TaPod-A1a等位變異的材料，具有TaPod-D1b等位變異材料的POD活性顯著高于具有TaPod-D1a等位變異的材料。時佳等[18]利用TaPod-7D1和TaPod-7D6標記對243份中國小麥材料進行了檢測，結合POD活性表型數據分析，卻發現具TaPod-D1a等位變異的材料具有更高的POD活性，研究結果與其研究結果不一致，主要原因是POD的活性受遺傳因子、生態環境和栽培措施等影響[15]，李鳳梅等[40]研究表明，微效基因以及環境和其他植物生長調節劑影響甜瓜性型；曹雪蓮等[41]發現基因間的互作及其與環境的互作對于小麥的抗穗發芽的影響較大；時佳等[42]通過產量功能標記檢測時，也發現同一功能標記會因為環境及材料不同等原因，造成同一功能標記在不同研究中出現沒有顯著差異甚至結果相反的現象。因此，在今后的工作中可通過擴大樣本量、提高樣本的遺傳多樣性，對TaPod-D1位點不同等位變異與POD活性相關性進行深入研究，將基于TaPod-D1基因開發的功能標記應用育種實踐。

4 結 論

在新疆小麥品種(系)材料中，以2個低POD活性等位變異類型TaPod-A1a和TaPod-D1a為主，且2個高POD活性等位變異類型TaPod-A1b/TaPod-D1b所占比例較少。TaPod-A1的功能標記POD-3A1和POD-3A2能較好的區分小麥籽粒POD活性的高低，可用于POD活性的分子標記輔助選擇。TaPod-D1功能標記POD-7D1和POD-7D6標記結果與POD活性測定結果相對于前人TaPod-D1a為高POD活性等位變異的結論不一致，該標記仍需擴大材料做進一步驗證。將2個功能標記組合使用，能更有效地篩選出高POD活性材料。