不同頻率電針對膜迷路積水豚鼠耳蝸形態及血漿AVP的影響

蔣麗元,史瑩鶯,葉恬恬,楊俊文,王欣

(1.杭州市中醫院,杭州 310007;2.杭州市丁橋醫院,杭州 310022;3.浙江中醫藥大學,杭州 310053;4.浙江省消防總隊醫院,杭州 310011)

梅尼埃病又稱美尼爾氏綜合征(Meniere’s disease, MD),是一種臨床常見內耳疾病。MD好發于40～50歲中年人,以發作性眩暈、波動性感音神經性聽力下降、耳鳴、耳悶脹感伴惡心、嘔吐為典型的臨床表現[1]。電針治療 MD能疏通耳部氣血,改善前庭及內耳功能,緩解眩暈、耳鳴癥狀[2]。

MD的病理基礎是膜迷路積水[3]。耳蝸積水程度與MD嚴重程度密切相關,膜迷路積水改善是緩解MD癥狀的關鍵。筆者在前期工作中證實電針能顯著減輕耳源性眩暈豚鼠膜迷路積水,改善耳蝸聽功能[4],與電針治療MD的臨床效果一致。電針刺激頻率是影響療效的重要參數。在電針治療MD的臨床報道中,相應刺激參數的選擇不盡相同,療效也有差異,但對于相同針刺方法而不同刺激參數(特別是頻率)的療效比較,至今尚缺乏研究報道,電針頻率選擇仍缺乏統一標準。電針在鎮痛方面具有頻率依賴性。電針對膜迷路積水的調節作用是否也存在頻率選擇性,電針又是通過什么機制減輕膜迷路積水,目前尚不明確。本實驗在醋酸去氨加壓素誘導的膜迷路積水模型上,以耳蝸病理為主要指標,觀察不同頻率電針對膜迷路積水的改善作用,篩選最佳電針頻率。并通過檢測血漿AVP的表達變化,初步探討電針治療梅尼埃病的可能機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用清潔級雄性白毛紅目豚鼠,體質量為(370±30)g,由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供[SCXY(浙)2013-0060,SYXK(浙)2013-0184]。實驗中對動物的所有處置均符合2006年國家科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定。實驗前豚鼠適應性飼養1周。豚鼠按完全隨機分為空白組、模型組、2 Hz電針組、15 Hz電針組、2/15 Hz電針組,每組8只。

1.2 試劑與儀器

醋酸去氨加壓素(海南中和制藥股份有限公司,批號20170701);AVP ELISA測試盒(上海江萊生物科技有限公司,批號 20190701C);華佗牌無菌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司,規格0.30 mm×13 mm);HANS-100 A型韓氏鎮痛電針儀(南京醫療儀器廠)。

1.3 豚鼠膜迷路積水模型的建立與評價

除外空白組,其余各組采用腹腔注射醋酸去氨加壓素建立膜迷路積水模型[5]。先按4 μg/kg/d給予腹腔注射,連續7 d,第8天將劑量加大為6 μg/kg/d,連續3 d,共10 d。第11天起開始干預。豚鼠膜迷路積水模型的評價以耳蝸病理切片 HE染色觀察結果為標準[5]。正常情況下耳蝸前庭膜平直,與基底膜約呈45°夾角。前庭膜將基底膜以上的空間分為兩部分,即前庭階和蝸管。前庭膜構成蝸管的上界,基底膜構成蝸管的下界,血管紋構成蝸管的外側界,前庭膜下蝸管橫截面積約為前庭階橫截面積的二分之一。當蝸管中內淋巴液含量增多,使前庭膜向前庭階方向聚攏,前庭膜膨脹隆起時,即為發生膜迷路積水,提示造模成功。本實驗以R值[蝸管橫截面積/(蝸管橫截面積＋前庭階橫截面積)比值]定量評估耳蝸積水程度。

1.4 分組與干預

空白組常規飼養,不予治療。模型組采取與電針組相同固定方式。各電針組于百會向前平刺 2 mm,左側聽宮直刺3 mm,接HANS-100 A型韓氏電針儀,輸出電流1 mA,留針20 min,每日1次,連續治療10 d。2 Hz電針組、15 Hz電針組、2/15 Hz電針組采用頻率分別為 2 Hz、15 Hz、2/15 Hz。豚鼠“百會”“聽宮”穴定位參照《實驗針灸學》[6]中的描述,采用動物比較學方法定位,于顱頂骨正中處選取“百會”穴,側面部耳屏正前方凹陷處選取“聽宮”穴。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般行為學觀察

觀察各組豚鼠一般行為學變化,包括豚鼠的精神狀態、毛發、步態、進食、體質量變化、自發活動情況、耳廓反應等一般情況。

1.5.2 血漿AVP濃度檢測

干預結束后,各組豚鼠以 10%水合氯醛按300 mg/kg劑量腹腔注射行全身麻醉,采血針經心尖穿刺,快速抽取2 mL全血置于肝素鈉抗凝管中。全血于4℃3000 rpm離心15 min分離血漿。血漿AVP檢測采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法。血漿AVP濃度以pg/mL表示。

1.5.3 豚鼠耳蝸形態

豚鼠麻醉狀態下快速打開胸腔,充分暴露心臟,4%多聚甲醛(pH=7.2)灌注,打開左側聽泡,取出顳骨,將顳骨標本置于 4%多聚甲醛固定液中,固定過夜后將標本置于10%乙二胺四乙酸(pH=7.4),室溫下脫鈣約3周,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。沿耳蝸蝸軸中央平面切片,每片厚約 4.5 μm,HE染色后光鏡觀察耳蝸形態。運用IPP系統測量耳蝸中軸兩側第二轉蝸管橫截面積及前庭階橫截面積,計算蝸管橫截面積/(蝸管橫截面積＋前庭階橫截面積)比值(R值),兩側取平均值。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0軟件分析結果。各組數據符合正態分布及方差齊,以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,均數間兩兩比較采用LSD檢驗法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學觀察

適應性喂養期間,豚鼠均精神狀態良好,毛發密集而有光澤,步態自如,飲食正常,體質量自然增加,自發活動多,耳廓反應靈敏。造模后,模型組豚鼠普遍出現精神萎靡,輕微脫毛,步態遲緩,進食減少,體質量增長緩慢甚至出現下降,活動減少,耳廓反應遲鈍。干預后,各頻率電針組豚鼠精神狀況、皮毛光亮程度、飲食、體質量、自發活動情況與模型組比較無差別,但耳廓反應靈敏度與模型組比較,有所改善。

2.2 血漿AVP濃度比較

經單因素方差分析,各組血漿 AVP濃度比較差異具有統計學意義(F=12.022,P=0.000＜0.01)。與空白組比較,模型組豚鼠血漿 AVP濃度增加(P＜0.01);與模型組比較,各電針組豚鼠血漿 AVP濃度均降低(P＜0.05);各電針組比較,2/15 Hz電針組較2 Hz電針組、15 Hz電針組降低,差異有統計學意義(P＜0.05);2 Hz電針組、15 Hz電針組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組豚鼠血漿AVP濃度比較 (±s,pg/mL)

表1 各組豚鼠血漿AVP濃度比較 (±s,pg/mL)

注:與空白組比較 1)P＜0.01;與模型組比較 2)P＜0.05,3)P＜0.01;與2 Hz電針組比較4)P＜0.01;與15 Hz電針組比較5)P＜0.05

組別 n AVP濃度空白組 8 36.66±3.19模型組 8 42.37±1.671)2 Hz電針組 8 39.01±2.082)15 Hz電針組 8 36.80±3.643)2/15 Hz電針組 8 33.98±1.443)4)5)

2.3 各組豚鼠耳蝸形態

經單因素方差分析,各組R值比較差異具有統計學意義(F=10.495,P=0.000＜0.01)。與空白組比較,模型組豚鼠耳蝸R值增加(P＜0.01);與模型組比較,各電針組豚鼠耳蝸R值均降低(P＜0.05);各電針組比較,2/15 Hz電針組較2 Hz電針組、15 Hz電針組降低,差異有統計學意義(P＜0.05)。2 Hz電針組、15 Hz電針組比較差異無統計學意義(P＞0.05)(見表2)。

空白組豚鼠均未出現膜迷路積水,前庭階、鼓階、蝸管結構無異常;模型組出現膜迷路積水,表現為前庭膜向前庭階方向不同程度的隆起擴張;2 Hz電針組、15 Hz電針組、2/15 Hz電針組前庭膜隆起程度均較模型組不同程度的減輕;2/15 Hz電針組前庭膜隆起程度較2 Hz電針組、15 Hz電針組減輕,2 Hz電針組、15 Hz電針組前庭膜隆起程度無明顯差異(見圖1)。

表2 各組耳蝸R值比較 (±s)

表2 各組耳蝸R值比較 (±s)

注:與空白組比較 1)P＜0.01;與模型組比較 2)P＜0.05,3)P＜0.01;與2 Hz電針組比較4)P＜0.05;與15 Hz電針組比較5)P＜0.05

組別 n R值空白組 8 0.29±0.04模型組 8 0.49±0.061)2 Hz電針組 8 0.40±0.102)15 Hz電針組 8 0.39±0.073)2/15 Hz電針組 8 0.32±0.063)4)5)

3 討論

中醫學中無“梅尼埃病”具體病名的記載。根據MD臨床表現,散見于中醫古籍所描述的“眩暈”“瞑?！钡确懂牎，F多將由MD引起的眩暈歸入“耳源性眩暈”。本虛標實為MD眩暈的基本病理性質,因此臨床對該病的治療多以補益為主?！鹅`樞·海論》記載:“髓海不足,則腦轉耳鳴”,故臨床治療眩暈首選與腦髓有關的穴位。百會歸屬督脈,具有補益腦髓、平肝熄風、開竅、止眩的功效,為治眩暈要穴。MD病位在耳,聽宮內通心、腦及肝膽之氣,針刺聽宮可疏利肝膽之氣,宣通耳竅,多用于內耳疾病的治療。臨床上常以百會配伍聽宮治療內耳眩暈癥[7]。本研究結果顯示,電針“百會”“聽宮”穴能顯著減輕膜迷路積水模型豚鼠的耳蝸積水程度,與課題組前期研究結果相符[8]。

研究者在應用電針治療耳聾過程中,觀察不同電針頻率對患者耳聾及其伴隨癥狀如眩暈、耳鳴、耳悶的影響,結果發現疏密波在提高患者聽力水平,改善眩暈等伴隨癥狀方面均具有良好效果,并推薦疏密波作為電針治療突發性耳聾的首選參數[9]。有文獻報道,疏密波類似于傳統醫學所稱的“補法”,密波類似于“瀉法”,認為疏密波可補益氣血、改善能量代謝,具有興奮作用,密波則具抑制作用[10]。MD病機以虛為主要特點,疏密波電針刺激輔助穴位,能加強補益作用,有效治療MD。韓濟生院士在研究電針鎮痛的過程中指出,長時間應用單調的頻率脈沖電針刺激容易使機體產生針刺耐受現象,降低針刺效應,2 Hz/15 Hz或2 Hz/100 Hz相互交替的波形鎮痛作用最佳[11]。但目前有關何種頻率電針治療MD最佳,還鮮見有文獻報道。課題組的前期研究中,觀察了電針對豚鼠膜迷路積水的干預作用,選擇的電針刺激參數為2 Hz頻率與15 Hz頻率交替的疏密波,并證實了該頻率、波形電針刺激對膜迷路積水干預的有效性[8,12]。那么2 Hz/15 Hz疏密波對膜迷路積水的干預作用是否優于單一的2 Hz或15 Hz電針頻率?因此,本次研究在前期工作基礎上,進一步觀察了2 Hz、15 Hz、2 Hz/15 Hz對膜迷路積水的干預效應差異。結果顯示,2 Hz、15 Hz、2 Hz/15 Hz電針干預豚鼠膜迷路積水均有良好的治療作用。各電針組間比較,2 Hz/15 Hz電針療效最佳。

圖1 各組豚鼠耳蝸形態變化(HE染色,×50)

AVP是一種9肽類激素,主要在下丘腦的視上核和室旁核中合成。研究發現,MD患者眩暈癥狀急性發作期與緩解期的血漿 AVP均較正常水平升高,且急性發作期 AVP升高的幅度遠大于緩解期間[13],而通過改善生活方式減少AVP釋放可有效緩解MD患者癥狀發作[14]。AVP水平病理性升高在MD發生發展中起著重要作用[15]。動物實驗表明,經腹腔注射 AVP在誘發膜迷路積水的同時[16],血漿AVP也出現較正常組豚鼠升高,膜迷路積水程度與血漿AVP升高水平相關[12]。下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)是機體內分泌系統的中樞部位,在維持人體內環境穩態,協調機體功能方面起關鍵作用。AVP可調節垂體激素分泌,被認為是HPA軸的決定性調節因素之一。外源性AVP長時間注射引起的垂體激素釋放異常影響 HPA軸反饋調控機制,下丘腦分泌 AVP功能出現異常,可能是引起 AVP病理性升高的重要原因之一。電針局部穴位,可通過調整HPA軸,改善機體內分泌功能,對 HPA軸的調節與機體狀態密切相關。Park HJ等[17]發現,針刺通過調節HPA軸使新生期經母嬰分離處理誘導的抑郁焦慮模型幼年大鼠血漿皮質醇、促腎上腺皮質激素濃度降低,下丘腦室旁核 AVP免疫反應減弱。金小千[18]研究發現電針可使慢性疲勞大鼠血清皮質醇與促腎上腺皮質激素濃度水平下降,調節下丘腦內神經遞質的表達,對 HPA軸具有良性調節作用。本實驗中電針百會、聽宮穴可使膜迷路積水豚鼠異常升高的AVP水平降低,可能與對HPA軸的良性調節有關。AVP通過刺激血管加壓素受體 2激活 AVPAQP2(aquaporin-2)系統,在抗利尿及維持血漿滲透壓的穩定方面起關鍵作用[19-20]。因此,電針可能通過調節HPA軸使血漿AVP水平降低,AVP-AQP2系統受到良性調節而使膜迷路積水程度減輕。

綜上所述,各電針組治療均能減輕豚鼠膜迷路積水,其中2 Hz/15 Hz電針效果最佳,推測其作用機制可能與下調血漿AVP的表達有關。