固相萃取-高效液相色譜法同時測定果蔬中吡蟲啉和多菌靈殘留量

楊宇霞 韓建欣 李 慧 趙 欣

（山西省生物研究院有限公司，山西太原 030006）

吡蟲啉（Imidacloprid） 又名海正吡蟲啉，化學(xué)名稱為1-（6-氯吡啶-3-吡啶基甲基） -N-硝基亞咪唑烷-2-基胺，屬硝基亞甲基類內(nèi)吸殺蟲劑，主要用于防治刺吸式口器害蟲及其抗性品系。多菌靈（Carbendazim） 又名棉萎靈，化學(xué)名稱為N-（2-苯駢咪唑基） -氨基甲酸甲酯，是一種苯并咪唑類殺菌劑，主要用于防治由真菌引起的病害。吡蟲啉和多菌靈均為新一代內(nèi)吸性殺菌劑，具有廣譜、高效、低毒的特點，被廣泛用于蔬菜、水果的病蟲害防治上，其殘留會對人體造成一定的危害。因此，改進吡蟲啉和多菌靈殘留的檢測方法、提高檢測效率十分必要。

目前，我國已頒布了多項吡蟲啉和多菌靈殘留檢測標準，主要檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。液質(zhì)聯(lián)用法雖然有較低的檢出限，但儀器價格昂貴、技術(shù)要求較高、普及度不夠；高效液相色譜法因其定性定量準確可靠、儀器價格適中，成為現(xiàn)在普遍采用的方法，然而現(xiàn)行標準都只是針對其中的某一種進行測定，且前處理較繁瑣復(fù)雜。因此，本文通過對樣品前處理方法和HPLC 分析條件的優(yōu)化，建立了同時檢測果蔬中吡蟲啉和多菌靈殘留量的高效液相色譜法，方法簡便、高效，能滿足日常檢測的需求。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

吡蟲啉、多菌靈標準品，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；乙腈（色譜純），霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；二氯甲烷（分析純），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；試驗用水為超純水。

試樣材料購于太原農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；T10 分散機，廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；TG16-GS 高速離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；MS3 digital 漩渦混合器，廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；ASE-24 固相萃取裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；GM-1.0A 隔膜真空泵，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；KD200 氮氣吹掃儀，杭州奧盛儀器有限公司；Cleanert-NH2 固相萃取柱（500 mg/6 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；NW150V 型超純水系統(tǒng)，上海康雷分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

吡蟲啉標準中間液的配制：吸取一定量吡蟲啉儲備液，用甲醇溶解并稀釋成10 μg/mL 的標準中間液，密封，于4 ℃冰箱中貯存。

多菌靈標準中間液的配制：吸取一定量多菌靈儲備液，用甲醇溶解并稀釋成50 μg/mL 的標準中間液，密封，于4 ℃冰箱中貯存。

混合標準溶液的配制：準確吸取吡蟲啉中間液0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.0 0mL，多菌靈中間液0.01 mL、0.02 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL 分別加入6 個10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即配成吡蟲啉質(zhì)量濃度分別為0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL，多菌靈質(zhì)量濃度分別為0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.50 μg/mL、5.00 μg/mL 的混合標準使用液，密封，于4 ℃冰箱中貯存。

快遞屬于技術(shù)含量較低、市場準入門檻不高的行業(yè)，由于從業(yè)人員的素質(zhì)、經(jīng)營管理方式等問題，導(dǎo)致了目前快遞業(yè)很難給用戶提供穩(wěn)定而有效的服務(wù)。少數(shù)企業(yè)片面追求經(jīng)濟利益，服務(wù)內(nèi)容和方式過于簡單，在解決消費者糾紛時，態(tài)度較差，不管有沒有責(zé)任先推諉，這些都導(dǎo)致部分用戶對快遞企業(yè)不滿，甚至引發(fā)矛盾升級。規(guī)范快遞行業(yè)經(jīng)營秩序，保障整個市場健康發(fā)展，已事在必行。同時，針對無照經(jīng)營的”黑”快遞，執(zhí)法部門應(yīng)加大聯(lián)合監(jiān)管執(zhí)法力度，加強政府監(jiān)督，從而營造合法有序的快遞市場環(huán)境，更加有效地保護消費者的合法權(quán)利。

1.3.2 樣品制備

稱取蔬菜、水果樣品可食部分約300 g，將其切碎，用攪拌機粉碎，裝入容器，密封備用。

1.3.3 樣品提取

準確稱取25.00 g 試樣，置于250 mL 高型燒杯中，加入50 mL 乙腈，4-5 檔高速勻漿2 min 后，于10 000 r/min 離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到裝有5 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈振蕩2 min，室溫下靜置分層。

1.3.4 樣品凈化

取10 mL 上清液于刻度試管中40 ℃氮氣吹至近干。加入2.0 mL 甲醇-二氯甲烷（1+99） 溶解殘渣，渦漩2 min，待凈化。將氨基柱用4.0 mL 甲醇-二氯甲烷（1+99） 預(yù)洗活化，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化液，收集洗脫液于13 mL 刻度試管中，用2.0 mL 甲醇-二氯甲烷（1+99） 潤洗刻度試管后過柱，重復(fù)2 次。將洗脫液于40 ℃氮氣吹至近干，用流動相溶解定容至2.5 mL，渦漩2 min 后，用孔徑0.22μμm 有機濾膜過濾，上機檢測。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（32∶68）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

分別采用勻漿和勻漿加超聲2 種方法進行提取試驗，結(jié)果表明，2 種方法處理的結(jié)果無明顯差異，回收率均符合試驗要求，故選擇操作簡單、省時的勻漿作為最終提取方法。

2.1.2 凈化條件的選擇

選擇C18小柱和氨基小柱為固相萃取柱進行凈化試驗，經(jīng)試驗表明，氨基柱處理除雜質(zhì)比較徹底、干擾少、重復(fù)性好，因此選擇氨基柱作為固相萃取小柱。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

分別考察了Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse Plus C18柱對吡蟲啉和多菌靈的分離效果。結(jié)果顯示，在相同色譜條件下，Eclipse Plus 柱的分離效果較好，且柱壓較低、保留時間較短，故選擇Eclipse Plus 柱作為試驗用色譜柱。吡蟲啉和多菌靈混合標準溶液色譜圖見圖1。

2.2.2 流動相組成及比例的選擇

分別以甲醇、水和乙腈、水為流動相進行試驗，試驗結(jié)果表明，乙腈水為流動相時，吡蟲啉的保留時間短，很難與其他雜質(zhì)干擾峰徹底分離，故選擇甲醇水作為流動相組成。

固定甲醇水作為流動相組成，分別考察了比例為30∶70、32∶68、35∶65、40∶60 的條件下，對分離效果的影響。結(jié)果表明，比例為40∶60 時，吡蟲啉由于保留時間太短，易受其他雜質(zhì)峰的干擾，分離度較差。隨著甲醇比例的減少，保留時間延長，分離度增大，當達到32∶68 時，吡蟲啉與多菌靈的保留時間和分離效果均達到理想狀態(tài)。隨著甲醇比例的繼續(xù)減少，保留時間繼續(xù)延長，靈敏度降低，因此最終選擇甲醇和水比例為32∶68 作為試驗條件。

2.3 方法的線性關(guān)系與檢出限

分別對各系列濃度的混合標準工作溶液進行測定，以色譜峰面積Y 對其質(zhì)量濃度X（μg/mL） 進行線性回歸，繪制標準曲線，以3 倍信噪比對應(yīng)的含量計算吡蟲啉、多菌靈檢出限（S/N=3），線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表1。結(jié)果表明，吡蟲啉在0.02 μg/mL～1.00 μg/mL、多菌靈在0.05 μg/mL～5.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R≥0.999 9。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 準確度與精密度試驗

采用在樣品中加標的方法進行回收率與精密度的測定。分別添加0.05 μg/g、0.10 μg/g、0.20 μg/g 3個水平的標準品，按照本研究優(yōu)化的方法進行加標回收率試驗，每個加標水平平行測定6 次，精密度和回收率結(jié)果見下頁表2。由表2 可以看出，蔬菜、水果樣品中吡蟲啉、多菌靈在0.05 μg/g～0.20 μg/g添加水平下，回收率為85.1%～100.5%，相對標準偏差在1.6%～6.6%之間，該方法測定吡蟲啉、多菌靈殘留量準確度和精密度良好。

圖1 吡蟲啉和多菌靈混合標準溶液色譜圖

表2 精密度和回收率結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

建立了固相萃取-高效液相色譜同時測定水果、蔬菜中吡蟲啉和多菌靈殘留量的方法。通過對前處理過程和色譜條件的優(yōu)化，確定了最佳提取、凈化條件和色譜條件。在設(shè)定的色譜條件下，吡蟲啉和多菌靈的檢出限為0.005 μg/g 和0.019 μg/g，相關(guān)系數(shù)達0.999 9 以上，回收率為85.1%～100.5%，相對標準偏差在1.6%～6.6%之間，該方法簡便、高效，適用于果蔬中吡蟲啉和多菌靈殘留量的同時測定。