槲皮素對PGN誘導的大鼠腸黏膜微血管內皮細胞炎性損傷的作用及其機制研究

劉 萍，卞藝斐，鐘 佳，周期律，劉鐘杰

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.中國農業大學動物科技學院，北京 海淀 100193)

槲皮素是一種廣泛存在于多種中草藥中的天然黃酮類化合物，有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和維持血管通透性等生物學活性。在腸源性感染性疾病的病程中，微血管內皮細胞的保護和修復，發揮著重要的作用。在這個過程中，Toll樣受體2(Toll like receptor,TLR2)介導肽聚糖(Peptidoglysean,PGN)誘導的信號通路，它通過激活MyD88信號通路，激活NF-κB、p38 MAPK、JNK1/2等一系列與炎癥反應相關的核轉錄因子[1]，刺激細胞分泌TNF-α、IL-6等一系列炎性細胞因子和趨化因子，參與炎癥反應，引起微血管內皮細胞的損傷。本研究應用PGN誘導大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(Rat intestinal mucosal microvascular endothelial cells，RIMMVECs,RIMMVECs)炎性損傷模型，探究槲皮素對RIMMVECs炎性損傷的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品 槲皮素標準品(Z100081)，購自國家食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑 高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶，均購自Biological Industries公司；PGN(69554)，購自Sigma公司；CCK8試劑盒(CK04)，購自東仁化學科技公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(438204)，購自BioLegend公司；RNA快速提取試劑盒和反轉錄試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；qPCR Supermix，購自北京全式金生物技術有限公司；TLR2、TLR4、MyD88大鼠單克隆抗體，均購自Abcam公司。

1.3 引物設計 從GenBank中查閱大鼠TLR2、TLR4基因序列，利用Primer Premier 5.0設計軟件進行引物設計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目的基因引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 主要儀器 高速離心機(美國Scilogex公司)；實時熒光定量PCR儀(羅氏診斷產品有限公司)；酶標儀(Thermo Scientific公司)；蛋白電泳儀、電泳槽(BIO-RAD公司)。

1.5 方法

1.5.1 RIMMVECs細胞培養 按照參考文獻[2]所述培養RIMMVECs細胞。

1.5.2 槲皮素作用濃度的篩選 RIMMVECs細胞以1.5×104/孔接入96孔細胞培養板中，待長至70%～80%單層融合狀態，吸棄培養基，加入不同濃度含槲皮素培養基，培養24 h后吸棄藥液，加入含10% CCK8的DMEM培養基，37 ℃避光培養2 h。450 nm波長檢測吸光度。

1.5.3 試驗分組與處理 RIMMVECs細胞以5×105/瓶接入25 cm2細胞培養瓶，待細胞長成單層融合狀態，進行分組處理。(1)空白對照組(CON，空白培養基24 h+空白培養基6 h)；(2)模型對照組(PGN，空白培養基24 h+15 μg/mL PGN培養基6 h)；(3)80 μmol/L濃度槲皮素作用+PGN組(QUE 80 μmol/L，80 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/mL PGN培養基6 h)；(4)40 μmol/L濃度槲皮素作用+PGN組(QUE 40 μmol/L，40 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/mL PGN培養基6 h)；(5)20 μmol/L濃度槲皮素作用+PGN組(QUE 20 μmol/L，20 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/ml PGN培養基6 h)；(6)10 μmol/L濃度槲皮素作用+PGN組(QUE 10 μmol/L，10 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/mL PGN培養基6 h)。

1.5.4 細胞TLR2、TLR4 mRNA水平的測定 收取細胞，參照RNA快速提取試劑盒和反轉錄試劑盒說明書進行RNA提取和反轉錄。采用FQ-PCR對細胞TLR2、TLR4 mRNA水平進行測定。反應體系20 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L，0.4 μL)、PCR Reverse Primer (10 μmol/L，0.4 μL)、cDNA 0.8 μL、ddH2O(8.4 μL)和qPCR Supermix(10 μL)。使用實時熒光定量PCR儀，按照反應程序(94 ℃預變性30 s后，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，重復40個反應循環)進行擴增，計算mRNA相對表達水平。

1.5.5 細胞TLR2、TLR4、MyD88蛋白水平的測定 細胞經2.3步驟處理后，收集上清用于炎性因子TNF-α測量。冷PBS洗2次，細胞刮收集細胞，裂解后提取總蛋白。按參考文獻[3]所述進行蛋白免疫印記，測定TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達水平。

1.5.6 細胞TNF-α分泌量的測定 取步驟2.5收集的細胞上清，根據大鼠TNF-α ELISA試劑盒說明書進行測定。

1.5.7 數據處理 IBM SPSS17.0軟件對試驗結果進行分析處理。試驗數據以平均值±標準誤(mean ± SEM)表示，單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗試驗組間差異性。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素對RIMMVECs細胞活力的影響 由圖1可知，相對于空白對照組，160 μmol/L槲皮素組細胞活力顯著降低(P<0.05)，80、40、20、10、5、2.5 μmol/L和1.25 μmol/L槲皮素作用組細胞活力無明顯變化(P>0.05)。因此，選擇80、40、20 μmol/L和10 μmol/L為下一步試驗的槲皮素作用濃度。

圖1 槲皮素對RIMMVECs細胞存活率的影響Fig.1 Effect of quercetin on RIMMVECs viability*：與空白對照組(槲皮素濃度為0 μmol/L)比較，P<0.05*:Compared with control group (quercetin=0 μmol/L)，P<0.05

2.2 槲皮素對TLR2、TLR4 mRNA水平的影響 由圖2可知，PGN刺激后，TLR2和TLR4 mRNA水平顯著增加(P<0.05)，相對于模型對照組，80、40、20 μmol/L和10 μmol/L槲皮素預處理能顯著降低PGN刺激的RIMMVECs細胞的TLR2 mRNA水平(P<0.05)，而80、40 μmol/L和20 μmol/L槲皮素預處理能顯著降低PGN刺激的RIMMVECs細胞的TLR4 mRNA水平(P<0.05)，10 μmol/L槲皮素預處理對TLR4 mRNA水平作用不明顯(P>0.05)。

2.3 槲皮素對TLR2、TLR4和下游MyD88 蛋白表達水平的影響 由圖3可知，PGN刺激細胞后，TLR4和MyD88蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)，TLR2和TLR4總表達量顯著升高(P<0.05)。對于模型對照組，80 μmol/L和40 μmol/L槲皮素預處理能顯著降低TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達水平(P<0.05)。

圖2 槲皮素對TLR2、TLR4 mRNA水平的影響Fig.2 Effect of quercetin on TLR2 and TLR4 mRNA expression*：與空白對照組比較,P<0.05；#：與模型對照組比較,P<0.05；下圖同*:Compared with control group,P<0.05;#:Compared with PGN group,P<0.05.The same as the following figures

2.4 槲皮素對炎性因子TNF-α分泌水平的影響 由圖4可知，PGN刺激RIMMVECs細胞后，其TNF-α分泌水平顯著升高(P<0.05)。相對于模型對照組，80、40 μmol/L和20 μmol/L槲皮素預處理均能顯著降低RIMMVECs細胞的TNF-α分泌量(P<0.05)。

3 討論

槲皮素是多種中藥的主要有效成分之一，有良好的抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤和神經保護[4-6]等作用，在畜牧獸醫領域具有較好的應有價值。我們之前的研究已表明，中藥馬齒莧水提液能有效保護試驗性結腸炎大鼠，顯著降低腸炎疾病活動指數，并抑制結腸TLR4及其介導的通路表達[7]。LPS和PGN等致病因子在結腸炎進展中起重要作用[8]。我們已通過前期研究發現，作為馬齒莧的主要有效成分，槲皮素能有效保護LPS誘導的RIMMVECs炎性損傷[2]。然而，槲皮素對PGN誘導的RIMMVECs炎性損傷的作用及其作用機制還未有相關報道。本研究中，利用PGN誘導RIMMVECs細胞造成炎性損傷模型，從內皮細胞炎性損傷層面上評估了槲皮素在腸源性感染性和細菌性疾病進程中的作用。

PGN，又稱肽聚糖，是革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細胞壁的主要成分[9]。作為TLR2的配體，PGN能激活單核、巨噬細胞和內皮細胞的TLR2、TLR4蛋白表達[10]，釋放多種細胞因子，進一步誘發炎癥反應。在本試驗中，先通過CCK8法篩選出了合適的槲皮素作用濃度(80、40、20 μmol/L和10 μmol/L)。基于此，發現不同濃度的槲皮素能顯著降低TLR2、TLR4蛋白mRNA水平，降低TLR2、TLR4及下游MyD88蛋白表達，降低炎性因子TNF-α釋放量(P<0.05)。

圖3 槲皮素對TLR2、TLR4和下游MyD88 蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of quercetin on TLR2,TLR4 and MyD88 protein expression

圖4 槲皮素對炎性因子TNF-α分泌水平的影響Fig.4 Effect of quercetin on TNF-α secretion

在腸道炎癥反應中，微血管內皮細胞不僅承擔了通常意義上的屏障作用，也是多種細菌致病產物的作用靶點，參與了多種細胞因子分泌過程[11]。在PGN由腸腔進入腸黏膜微血管循環時，腸黏膜微血管內皮細胞發生炎性損傷，并誘發進一步的瀑布式炎癥級聯反應。本試驗證明了槲皮素可以通過調控TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表達抑制PGN誘導的RIMMVECs細胞分泌TNF-α，從而抑制細胞的炎性損傷。本項研究證明，槲皮素能保護PGN導致的腸黏膜微血管內皮細胞炎性損傷，但槲皮素在腸源性疾病中其他層面的作用尚待進一步研究。