38味中藥對豬大腸桿菌的體外抑菌活性

徐倩倩，呂素芳，李 峰，張冉冉，王怡晴，劉青青，王艷萍，沈志強

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院 山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發推廣中心，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動物藥業有限公司，山東 濱州 256600；3.濱州醫學院藥學院，山東 煙臺 264003)

大腸桿菌感染引起的豬病主要有新生仔豬腹瀉、斷奶仔豬腹瀉(PWD)、水腫病(ED)[1]等。隨著集約化養豬業的發展，致病性大腸桿菌所導致的仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病，成為養豬場常發的傳染病，也是引起仔豬死亡的重要原因之一，對養豬業造成較大的威脅和重大的經濟損失[2]。全國多地都有豬源大腸桿菌多重耐藥的報道[3-4]。尋找替代抗生素的治療或者預防方法成為畜牧業持續穩定發展亟需解決的問題。在我國，利用中藥防治腹瀉己有幾千年的歷史，并在防治畜禽疾病中發揮了巨大作用。近年研究顯示，中藥如黃芩、黃連、黃柏等對豬源大腸桿菌皆有不同程度的體外抑菌效果[5-7]，中藥對于大腸桿菌能有效抑菌,臨床治愈率為90%之多[8]。因此，本試驗的目的是篩選對臨床分離多重耐藥豬大腸桿菌有抑菌、殺菌作用的中藥，并分析部分中藥的聯合抑菌效果，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 中藥材 烏梅、茵陳、魚腥草、連翹、射干、青蒿、知母、薄荷、香薷、蒼術、陳皮、石菖蒲、艾葉、黃芪、大黃、黃芩、蒲公英、當歸、訶子、五味子、金銀花、炙甘草、黃連、板藍根、山楂、蘆薈、大青葉、紫花地丁、苦參、梔子、厚樸、白頭翁、秦皮、黃柏、胡黃連、穿心蓮、蘇木、白芷，均購自山東濱州瑞豐藥店，所有藥材飲片經鑒定均符合生藥質量標準。

藥敏紙片7種，阿米卡星[批號：180926，含量：(30±7.5) μg/片]、慶大霉素[批號：180927，含量：(10±2.5) μg/片]、左氟沙星(批號：180922，含量：5 μg/片)、青霉素G(批號：180913，含量：10 U/片)、多黏菌素B(批號：180923，含量：300 U/片)、鏈霉素(批號：180908，含量：10 μg/片)、阿莫西林(批號：180829，含量：10 μg/片)，均購自杭州市濱和微生物試劑有限公司。

1.2 供試菌株 豬大腸桿菌均為臨床分離株，由山東省濱州畜牧獸醫研究院李峰研究員惠贈；豬大腸桿菌O101：K41(菌株編號為ATCC83707)為標準菌株，由山東綠都生物科技有限公司菌種中心提供。

1.3 培養基、試劑 普通肉湯培養基(批號：20160810)，購自青島市高科園海博生物技術有限公司。普通營養瓊脂培養基(批號：160618 14)、M-H肉湯培養基(批號：160321 1)、M-H瓊脂培養基(批號：180822 1)，均購自北京陸橋技術有限責任公司。按照說明書操作，高壓滅菌后使用。麥氏比濁管(批號：RJ19030)購自溫州市康泰生物科技有限公司。

1.4 主要儀器設備 KDM型調溫電熱套，購自山東甄城華魯電熱儀器有限公司；RZ-52型旋轉蒸發儀，購自上海嘉鵬科技有限公司；SHB-B95A型循環水式多用真空泵，購自上海豫康科教儀器設備有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機，購自上海安亭科學儀器廠；新華牌LMQ.C型立式滅菌器，購自山東新華醫療器械股份有限公司；300型電熱恒溫培養箱，購自龍口市先科儀器公司；96微孔板，購自上海拜力生物科技有限公司；SW-CJ醫用型潔凈工作臺，購自蘇州安泰空氣技術有限公司；8通道微量移液器(10～100 μL)、單道移液器(10～100 μL、100～1 000 μL)，購自Thermo公司；ZD-85恒溫振蕩器，購自常州國華電器有限公司；BCD-199FD冰箱，購自澳柯瑪股份公司；210.3型電子天平，購自上海賽多利斯儀器設備有限公司。

1.5 中藥提取液的制備 分別取各單味藥材大青葉、紫花地丁、梔子、金銀花、魚腥草、青蒿、薄荷、艾葉、蒲公英、穿心蓮各30 g，加10倍量水浸潤30 min，然后添加到12倍量的水加熱煮沸，煮沸后改文火煎煮1 h，過濾，濾渣再加10倍量水煎煮1 h，過濾，取上清，合并2次藥液；另外，烏梅、茵陳、連翹、射干、知母、香薷、蒼術、陳皮、石菖蒲、黃芪、大黃、黃芩、當歸、訶子、五味子、炙甘草、黃連、板藍根、山楂、蘆薈、苦參、厚樸、白頭翁、秦皮、黃柏、胡黃連、蘇木、白芷，分別各取50 g，加8倍量水浸潤30 min，然后添加到10倍量的水加熱煮沸，煮沸后改文火煎煮1 h，過濾，濾渣再加10倍量水煎煮1 h，過濾，取上清，合并2次藥液，減壓濃縮到0.5 g/mL，3 000 r/min離心15 min，取上清，繼續濃縮至1 g/mL，105 ℃滅菌20 min，4 ℃保存，備用。

1.6 中藥制備液對豬大腸桿菌的體外抑菌效果

1.6.1 菌液的培養 試驗前將菌種接種到普通肉湯培養基中，置37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，使其活化，然后挑取典型菌落接種于5 mL普通營養肉湯中，37 ℃培養16～18 h，連續培養2代。第3代置37 ℃恒溫搖床中培養4 h左右，使其濁度達到1×106CFU/mL，備用。

1.6.2 紙片法測定常見抗生素對豬大腸桿菌的體外抑菌活性 取100 μL細菌培養液，分別接種涂布于M-H瓊脂培養基平板，取阿米卡星、慶大霉素、左氟沙星、青霉素G、黏菌素B、鏈霉素、阿莫西林等7種藥物的藥敏紙片均勻貼在平板表面，每個平板3種或4種紙片，每種藥物重復3次，37 ℃恒溫培養24 h后測定抑菌圈直徑(mm)。根據美國臨床實驗室標準化委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)推薦的標準K-B紙片法判斷結果。

1.6.3 中藥制備液對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定 取滅菌M-H肉湯培養基100 μL分別加入第2孔到第9孔，及第12孔；第1孔、第2孔和第10孔分別加入100 μL待測藥液，從第2孔開始依次倍比稀釋到第9孔；第1孔到第9孔及第11孔分別加入100 μL菌液，即：第1孔到第9孔的中藥制備液濃度分別為(500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9、1.95 mg/mL)，第10孔為藥物對照，第11孔為菌液對照，第12孔為肉湯培養基對照，每個試驗3個重復，37 ℃恒溫培養24 h后取出。從各試驗孔中分別取100 μL液體接種涂布于M-H瓊脂培養基平板，經37 ℃培養24 h 后觀察結果。以菌落分散生長的視為有抑菌效果，此最低濃度值為其MIC值；以肉眼觀察無菌落生長為100%被殺滅，此最低濃度值為其MBC值。參考代如意等[9]介紹的判斷標準，MIC<7.8 mg/mL為高度敏感，7.8 mg/mL≤MIC≤250.00 mg/mL為中度敏感，MIC>250.00 mg/mL為不敏感。

1.6.4 10味中藥聯合抑菌試驗 采用肉湯稀釋棋盤法，測定10味中藥聯合作用時的體外抗菌活性，以各中藥對應MIC值的2倍、1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍等濃度分別進行聯合藥敏試驗，重復3次。試驗結果以聯合抑菌指數(Fractional inhibitory concentration index，FICI)作為聯合藥敏試驗的判斷依據：FICI≤0.5為協同作用；0.52為拮抗作用。FICI計算公式如下：

2 結果

2.1 耐藥性分析 以豬大腸桿菌標準菌株ATCC83707作為對照，發現臨床分離大腸桿菌對阿米卡星、慶大霉素、左氟沙星、青霉素G、鏈霉素、阿莫西林均耐藥，僅對多黏菌素B敏感；而標準菌株對青霉素G和阿莫西林耐藥，對其他5種常見抗生素均敏感。

表1 臨床分離菌株和標準菌株藥物敏感性實驗結果Table 1 Sensitivity of clinical isolated Escherichia coli and standard strain ATCC83707 to antibiotics

2.2 中藥制備水提液對大腸桿菌的體外作用 根據7.8 mg/mL≤MIC≤250.00 mg/mL為中度敏感的標準，發現臨床分離大腸桿菌對黃連、山楂、蘆薈、白頭翁、烏梅、香薷、艾葉、黃芩、蒲公英、訶子、五味子、蘇木表現為中度敏感，對其他中藥表現為不敏感；ATCC83707對黃連、山楂、蘆薈、大青葉、白頭翁、烏梅、艾葉、訶子、五味子、蘇木中度敏感，對其他藥物不敏感。

表2 38味中藥對臨床分離菌株和標準菌株MIC、MBC測定結果Table 2 MIC and MBC of 38 TCMs against clinical isolated Escherichia coli and standard strain ATCC83707 (mg/mL)

2.3 10味中藥提取液對臨床分離菌株的聯合抑菌效果 10味中藥提取物對臨床分離菌株的體外聯合抑菌活性見表3。黃連-蘆薈、黃連-訶子、山楂-蘆薈、山楂-訶子、山楂-訶子、蘆薈-烏梅、訶子-白頭翁等聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株呈現協同作用；黃連-山楂、黃連-烏梅、黃連-白頭翁、山楂-香薷、蘆薈-五味子、烏梅-香薷、烏梅-訶子、黃芩-訶子、訶子-五味子等聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株呈現相加作用；黃連-香薷、黃連-五味子等聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株呈現無關作用；剩余藥物聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株呈現拮抗作用。

3 討論

3.1 中獸藥仍然是治療細菌性疾病的方向 細菌的多重耐藥問題已成為世界關注的問題，我國也不斷減少獸醫臨床抗生素的用量和品種，逐漸尋找抗生素的替代產品。中獸藥具有的天然獨特優勢促使其理所當然地成為良好備選之一。對比臨床分離多重耐藥大腸桿菌和標準對照菌株，抗生素作用顯示出極大差別，臨床分離菌株僅對多黏菌素B敏感，對其他受試抗生素均表現耐藥，而標準菌株對大部分抗生素表現敏感，說明抗生素的可用范圍正在減小；而對比中獸藥，臨床分離菌株對黃連等12味中獸藥中度敏感，標準菌株對10味中獸藥中度敏感；2種菌株均對黃連、山楂、蘆薈、白頭翁、烏梅、艾葉、訶子、五味子、蘇木表現為中度敏感，這與一些報道的結果也是一致的[10]。香薷、黃芩、蒲公英臨床分離菌株敏感，而對標準菌株不敏感，說明中獸藥抗菌作用目前還未受到細菌耐藥與否的影響，因此中獸藥仍然是治療細菌性疾病的方向。

3.2 中獸藥的開發利用還有很長的路要走 在試驗過程中，最初選擇了牛津杯法、紙片法，但一些問題限制了上述2種方法的應用：成分復雜，有的成分影響藥物在瓊脂中的擴散，例如牛津杯法測定黃柏的抑菌效果時，黃柏本身的黏稠性使其難以擴散，影響結果觀察；中獸藥提取液中含有使紙片硬化的成分，一些中獸藥做成紙片后，藥物擴散不出。最終我們選擇的微量2倍稀釋法結合平板法，避免了顏色和雜質對結果判定的影響。

相比西藥，我們發現中獸藥有一定的抑菌效果，但其有效藥物濃度遠高于西藥，在臨床應用時受到很大限制，也有一些中獸藥通過進一步分離提取純化達到了較好的效果，例如黃芩苷對大腸桿菌的MIC為16 μg/mL[11]。還有另外一種可能就是中獸藥作用的方式存在多靶點的特點，在抑菌的同時還有抗炎、抗氧化、改變離子流動等其他作用途徑[12-13]，具體的作用機制及用藥方式還需要進一步研究。

表3 中藥對臨床分離大腸桿菌的聯合抑菌活性Table 3 FICI of sensitive TCM combination to clinical isolated Escherichia coli

3.3 聯合用藥后效果差別大 七情配伍是中藥用藥基礎，本試驗中，黃連-蘆薈等7對聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株呈現協同作用，可理解為相使配伍；黃連-山楂等9對中藥聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株呈現相加作用，可理解為相須配伍；黃連-香薷、黃連-五味子等聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株呈現無關作用，可單獨用藥；其余27對藥物聯合應用時，對臨床分離大腸桿菌菌株均呈現拮抗作用，可理解為相惡配伍。在文獻報道中，復方中藥不同配伍對臨床分離株大腸桿菌也呈現了不同的敏感性[14]。因此，在中獸藥臨床用藥中，在研究單味藥作用的同時，聯合用藥的藥效研究也是必不可少的。

3.4 一株菌不具有普遍意義 大腸桿菌多重耐藥的現狀是逐漸演變而來的，基因組也發生了不同的改變，因此，1株菌對中獸藥的敏感性只能給出一點提示，而不能代表全部，本試驗中臨床分離大腸桿菌對黃連MIC為250 mg/mL，對黃芩MIC為62.5 mg/mL，而文獻報道中黃連對豬大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑19 mm，遠高于黃芩11.6 mm[15]。因此，在研究過程中，還需要擴大臨床細菌樣本量，篩選效果穩定的，對各種菌株均具有抑菌效果的中藥。

4 結論

臨床分離大腸桿菌對常用抗生素呈現了多重耐藥趨勢，但對中藥仍然保持一定的敏感性，中獸藥可作為優良的抗菌產品；抗菌方面，中藥之間存在著復雜的相互作用，部分中藥間有協同作用或者拮抗作用，故臨床用藥時須謹慎篩選。