產表面活性劑菌微生物驅工藝及提高采收率效果研究

施寒清 石芳 何奇 王哲 梁正峰

東北石油大學提高油氣采收率教育部重點實驗室 黑龍江 大慶 163318

生物采油技術已經研究了幾十年，微生物單井吞吐技術已經趨于成熟，在國內外都有應用。目前在勝利、大慶、吉林等油田作業成功率在70%以上，在管線清防蠟、油水井解堵、抑制硫酸鹽還原菌和提高原油采收率方面取得了良好效果［1-3］。在提高原油采收率方面，微生物驅按區塊作業，具有大面積應用的潛力，但是從目前發表文獻來看微生物驅礦場試驗的效果總體不佳，提高采收率在0.13%到5%，還處于探索階段［1-2］。

實驗室從1994 年開始研究微生物采油，多年來也進行了一些有關微生物驅的研究，但也未突破低效的結果［4］。微生物驅主要靠產物或微生物的生長繁殖直接作用于原油，以提高原油地下流動性和水攜帶性使原油被采出。根據菌種提高采收率的原理，采用的方式和工藝流程會有所不同，而工藝流程和發酵過程的長短肯定會影響采油效果［1-2,5-7］。生物表面活性劑目前油田應用較多的是糖脂和脂肽類，是微生物的發酵產物，已有半提純產品銷售，應用時就可以如化學表面活性劑般應用，單獨使用生物表面活性劑的油水界面張力一般只能達到10?1mN/m［8-9］。由于微生物在發酵過程中除了生物表面活性劑還會產生其它物質，且微生物有的可以產生降解原油成分的物質，采用注微生物發酵液及培養基技術，省去了提純工藝，也可以大幅度降低成本［1-4, 10-11］。

實驗室一直從事地下發酵微生物驅研究，在大慶油田礦場試驗的結果為提高采收率2～3%，室內30 cm 方巖心驅油提高采收率在2～5%左右。從生物學代謝規律的角度，影響菌種的代謝和活躍能力的因素很多，培養時間的長短也會影響有效代謝產物的產生和積累，現場作業的菌種發酵液很多情況下已經發酵后放置很長時間，部分學者認為微生物沒死，只要達到菌數108個/mL 就行。筆者研究了產表面活性劑菌種Bsw(自命名菌株，選于大慶油田)的代謝規律，認為以前的工藝流程可能與該菌種代謝規律存在不一致性，影響了驅油效果。因此進行了產表面活性劑微生物驅工藝設計和提高采收率效果研究。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

Bsw 菌種及其發酵液、30 cm 方巖心、立式恒溫培養箱、模擬油、模擬地層水、油藏物理模擬驅替裝置、光學正置顯微鏡及攝像系統、超凈工作臺、紫外殺菌裝置、微量移液器；模擬油用大慶油田采油5 廠某聯合站脫氣原油配成在42 ℃黏度值為12 mPa · s的模擬油。

1.2 菌種生長培養基和菌種發酵培養

菌種：Bsw；培養基：葡萄糖硝酸鹽培養基；葡萄糖：2.0 g；玉米漿：0.8 g；NaNO3：0.2 g；Na2HPO4· 12H2O：0.1 g；KH2PO4：0.05 g；MgSO4· 7H2O：0.05 g；CaCl2(無水)：0.005 g；水:100 mL；pH:7.0～7.2；116 ℃濕熱滅菌20 min。

1.3 方法和步驟

(1)菌種鑒定：16SrDNA 鑒定步驟，克隆rDNA序列，連質粒，測序，NCBI 比對［12］。

(2)細菌形態染色觀察：草酸銨結晶紫單染，100×物鏡觀察并拍照。

(3)菌種培養表面活性劑合成和積累規律。在500 mL 三角瓶中裝200 mL 培養基, 接入200 μL 的20%甘油保存的菌種先置于39 ℃培養24 h, 然后將溫度調至42 ℃培養，每間隔24 h 觀察一次泡沫產生情況，如產生泡沫與空白培養基為對照，靜置30 min 觀察泡沫的穩定性及泡沫形態并拍照, 然后置搖床中繼續培養。連續觀察7～15 d 每次觀察時取樣1 mL 于1.5 mL 離心管中4 ℃保存。生物量的變化：將1.5 mL 離心管保存的樣品用12 000 rpm離心5 min 對比沉淀體積判斷。

(4)驅油方案：油藏溫度42 ℃，水驅注入速度、微生物段塞注入速度: 0.1 mL/min(相當于現場每天前進1 m)。

(5)菌種地下發酵工藝流程。取凍存菌種25 μL接種于含7 mL 培養基的試管中39 ℃好氧培養18 h，然后置室溫存放。從中取200 μL 發酵液接種于含200 mL 培養基的三角瓶中42 ℃好氧培養22 h，此時菌液含菌數應為108cell/mL, 然后取11 mL(接種量為總液量的1/20)接于200 mL 培養基中，在搖床上42 ℃搖30 min 以上，發酵液作驅油的微生物段塞。驅油實驗步驟：巖心飽和水-飽和油-水驅至含水率98%- 0.34 PV 發酵液段塞-關井15 d-水驅至含水率98%。

(6)地上好氧發酵注驅工藝流程。取200 μL 甘油凍存發酵液接種于含200 mL 培養基的三角瓶中39 ℃好氧培養15 d，此時菌液中已充分積累了鼠李糖脂等產物。然后取出40 mL 發酵液保存于4 ℃冰箱做理化測定用，補入40 mL 新培養基(總液量的1/5)置39 ℃好氧培養6 h，復壯發酵液中的菌體，該發酵液作驅油的微生物段塞。驅油實驗步驟：巖心飽和水-飽和油-水驅至含水率98%-0.34 PV 發酵液段塞-關井3 d-水驅至含水率98%。

(7)表面張力的測定：白金吊片法，Kino 自動表面張力測定儀。面張力的測定：Kino TX500D 旋轉滴自動界面張力測定儀。

2 結果與分析

實驗所用菌種，篩選自上世紀九十年代大慶油田油井的采出液，菌種用科學方法保存至今，在1 000 倍光學顯微鏡下菌體形態如圖1 所示。結晶紫單染為桿菌，經rDNA 測序，在NCBI 比對鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，表面活性物質主要為鼠李糖脂，該菌可以好氧和厭氧生長，都能產生生物表面活性劑。我們對好氧和厭氧條件下的發酵液的表面張力進行了測定，結果如圖2 所示。其中，15 d(原)：研究表面活性劑合成代謝規律的終培養液(好氧培養)；培養基：好氣三角瓶中的滅菌培養基；好氧：厭氧培養的菌種接好氧瓶培養7 d的培養液；厭氧：菌種接厭氧瓶培養15 d；厭氧去菌：厭氧發酵液離心除去菌體；測量溫度為25 ℃。

圖1 菌種結晶紫染色光學顯微鏡形態Fig. 1 Strain’s morphology after crystal violet staining under optical microscope

圖2 不同培養條件發酵液表面張力值的比較Fig. 2 Surface tension comparison between fermentation liquors under different culture conditions

圖中的結果顯示好氧培養7 d、15 d，厭氧培養15 d 的發酵液表面張力值都在23 到29 mN/m 之間，和培養基的表面張力50 mN/m 相比有明顯下降，說明都產生了表面活性劑。因此好氧和厭氧發酵工藝都可以用于生物采油。

為了弄清菌種的表面活性劑的合成和積累規律，進行了表面活性劑合成積累與發酵培養時間的關系研究。由于生物表面活性劑具有發泡功能，因此實驗用穩定泡沫的多少來間接反映表面活性物質的積累情況。如圖3 所示，培養4 d 和7 d 都可產生穩定的泡沫，而7 d 明顯泡沫比4 d 的多，說明培養時間延長，三角瓶中表面活性劑是在積累，由于在現場礦場試驗一般微生物注入后關井7 d，因此又進行了好氧培養發酵液的菌數變化實驗，實驗結果如圖4 所示。由圖中可以看到，從培養24 h 到7 d，培養液中的菌數按離心后體積看，沒有明顯變化，說明菌數在24 h 達到峰值后，處于相對穩定的狀態。由于中間沒有補充營養，因此在中后期菌體應處于休止期。由于在7 d 的這輪實驗中觀察到表面活性劑泡沫是從3 d 開始產生，且隨培養時間增加而增加，因此認為該菌種生物表面活性劑的產生屬野生型，受營養消耗調控，應符合Das 等的文獻對鼠李糖脂表達調控模式的報道。由于表面活性劑隨培養時間積累而產生變化，因此進行了好氧培養15 d 的表面活性劑合成積累規律實驗，結果如圖5 所示。在前7 d，穩定的泡沫是在3 d 開始明顯増多，隨培養時間的延長發泡能力増強，從8 d 開始雖然有些樣品泡沫減少，但是11 d，14 d 等樣品的泡沫顯示近似7 d或有增強，因此延長培養時間可以積累更多的表面活性劑。

圖3 好氧培養時長與表面活性劑積累的關系Fig. 3 Relationship between aerobiotic culture time and surfactant accumulation

圖4 不同好氧培養時間細菌菌數的變化(培養溫度38 ℃)Fig. 4 Variation of the number of bacteria with the aerobiotic culture time (culture temperature 38 ℃)

圖5 穩定泡沫量和培養時間的關系(液體體積0.9 mL，搖起泡后靜置30 min 拍照)Fig. 5 Relationship between the volume of stable foam and the culture time (liquid volume: 0.9 mL, taking photos after it is foamed and then rested for 30 min)

根據上述研究結果，Bsw 菌株的表面活性物質合成和積累有隨發酵培養時間延長產物增加的特點，考慮到地層是厭氧環境，厭氧代謝應該比好氧發酵明顯緩慢。這是由于以前現場礦場注入該菌種關井7 d，合成的表面活性劑較少，影響了采收率的提高。因此在以前的工藝基礎上延長了關井時間，將關井時間由7 d 延長至15 d。物理模擬裝置如圖6所示，巖心參數如表1 所示。

圖6 驅油巖心及連接設備Fig. 6 Oil displacement core and connection equipment

表1 各巖心參數Table 1 Core parameters

室內實驗結果如圖7，圖8，表2 所示。每塊巖心的驅油曲線圖分3 個時期，第一段為水驅到產出液含水率98%，第二段為微生物驅的菌液或培養基段塞注入階段，第三段為關井后水驅到產出液含水率98%。由于該菌株也可以利用原油生長繁殖，因此對原油也有降解作用，提高采收率值應是表面活性劑和原油降解綜合作用的結果，生物段塞為空白培養基的巖心為空白對照組(圖7)。注培養基時出了一些油，計算提高采收率為0.54%，可以認為是實驗誤差，因此可以認為注空白培養基基本無提高采收率效果。本次實驗注培養22 h 的菌種發酵液，進行地下發酵15 d 的工藝，開井水驅后出了一些油，但是提高采收率為2.83%(圖8，表2)，這與以前實驗室和礦場試驗的結果相近，因此延長地下發酵培養時間沒有產生明顯改善。

圖7 地下發酵空白培養基的注入方案驅油過程曲線Fig. 7 Injection plan and oil displacement process of underground-fermentation blank culture medium

圖8 地下發酵15 d 的注入方案驅油過程曲線Fig. 8 Injection plan and oil displacement process of 15 d underground fermentation

表2 各巖心驅油的采收率和提高采收率Table 2 Recovery factor and EOR of each oil displacement core

實驗結果并不理想，經綜合分析，原因可能是厭氧發酵產生的表面活性物質較少所致，因為商業生產的鼠李糖脂是由銅綠假單胞菌好氧發酵生產的，菌株Bsw 也可以好氧發酵產生生物表面活性劑，而且有隨培養時間增加積累的特點，據此從新設計了采油生產注入工藝，讓發酵液在地面好氧發酵充分積累表面活性劑，然后使休止細胞活化后再注入地層厭氧發酵。菌種在三角瓶中好氧發酵15 d 后，加入五分之一體積的新培養基，好氧培養6 h，細胞恢復活化狀態，然后將發酵液注入地層，厭氧發酵3 d。實驗結果如圖9, 圖10 所示。在1 000 倍光學顯微鏡下，圖9 中a 圖顯示好氧培養15 d 后菌種細胞形態為休止狀態，b 圖顯示加入新培養基培養6 h 菌種細胞形態轉變為活化狀態。這也說明，在長期產物積累和營養耗盡時，細胞還活著。在新工藝中，核心改變是將積累有效產物的過程放在地面發酵罐(實驗室三角瓶)好氧發酵完成，好氧發酵時細胞的合成代謝要比厭氧發酵快很多，因此產物積累充分。注入前將發酵液加入新培養基活化培養6 h 的目的是使細胞恢復旺盛生長狀態，以利于菌種在地下厭氧發酵，發揮細胞降解原油等方面的能力。由表2 和圖10 的結果顯示，采用新工藝的驅油實驗取得了提高采收率15.63%的效果。由于30 cm 方巖心可以指導現場生產，按實際施工提高采收率折半計算還有7%到8%的提高采收率，因此該結果應是有明顯生產意義的。有參考文獻報道，將2 種產生不同生物表面活性劑菌(一種產脂肽，一種產糖脂)混合注入地下，他們的室內實驗表明提高采收率17.38%，但是注入的生物段塞為1 PV。從現場施工角度考慮，段塞有些大，工藝設計中采用0.34 PV 的生物段塞比較符合大慶等油田的化學驅段塞大小，實驗中用單一菌種也取得了可觀的效果，因此可以認為工藝的改變確實可以取得明顯的生產效果。

圖9 好氧培養15 d 培養液和15 d 的培養液活化培養6 h 的菌體形態對比Fig. 9 Morphological comparison between the strain in culture solution for 15 d aerobiotic culture and that in 15 d culture solution for 6 h activated culture

圖10 地面發酵15 d 后活化6 h 菌液注入方案驅油過程曲線Fig. 10 Injection plan and oil displacement process of the bacteria solution after 15 d ground fermentation and then 6 h activation

菌株Bsw 具有降解原油的能力，以前做過以原油為碳源好氧和厭氧發酵的工作，從本輪實驗，2 種工藝驅油的效果來看，在地下發酵15 d 應比發酵3 d 對原油的降解作用更強，但是2 種工藝的提高采收率效果明顯不同，新工藝效果明顯，這也顯示菌株地下發酵的原油降解能力對提高采收率貢獻很小，有效產物的地面充分積累是取得明顯效果的關鍵因素。

為了探索改變工藝能明顯提高采收率的原因，進行了注入前的發酵液(留樣)對目標油藏原油的界面張力進行了測定。結果顯示，在油藏溫度下，油水界面張力為0.27 mN/m。雖然生物表面活性劑的發酵液，沒有象化學表面活性劑達到0.01 mN/m，但是由于微生物發酵液是復雜液體，因此能取得較好的提高采收率效果。

3 結論

(1) 產鼠李糖脂的菌株Bsw 可以地下厭氧發酵進行微生物驅，但是提高采收率不明顯，只有2.83%，延長關井時間至15 d 也沒有明顯改觀。

(2) 采用地面好氧發酵充分積累產物，然后活化菌株細胞注入地層再厭氧發酵的工藝，微生物驅提高采收率達到15.63%。

(3) 驅油實驗的結果表明，銅綠假單胞菌Bsw 好氧發酵比厭氧發酵能積累更多的表面活性物質，改變生物采油生產工藝，可以有效改善微生物驅效果。