血塞通泡騰片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量測(cè)定

何三民，余志怡，戴德雄

(1.浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000;2.浙江維康藥業(yè)有限公司，浙江 麗水 323000)

血塞通泡騰片為三七總皂苷加輔料制成的泡騰片，具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)之功效，用于腦路瘀阻、中風(fēng)偏癱、心脈瘀阻、胸痹心痛，腦血管病后遺癥、冠心病心絞痛屬上述證候者，臨床效果顯著。三七葉總皂苷中含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1，原顆粒劑采用紫外分光光度法測(cè)定人參總皂苷[1]，測(cè)定方法的準(zhǔn)確性差。為了有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)建立了高效液相色譜法[2-4]，用于測(cè)定血塞通泡騰片中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型液相色譜儀，浙江大學(xué)N 2000色譜工作站;島津UV-1240型紫外分光光度計(jì);Sartorius BP 211D型電子天平;JL-180 DTH型超聲波清洗器。人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)為110704-200420)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)為110703-200726)，三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)為110745-200415)，供含量測(cè)定用，由中國(guó)生物藥品制品檢定所提供;血塞通泡騰片(批號(hào)分別為20081101，20081201，20081203，20090602，20090702，20090703，浙江維康藥業(yè)有限公司);乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher試劑公司)，水為雙蒸水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromteck C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 -水溶液，梯度洗脫(表1);流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

精密稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1對(duì)照品適量，用甲醇溶解并制成每1 mL分別含0.40 mg人參皂苷Rb1、0.40 mg人參皂苷Rg1和0.10mg三七皂苷R1的對(duì)照品溶液。取本品10片，研細(xì)，稱取0.25 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，精密稱定，超聲提取30 min，取出放冷，稱定質(zhì)量，補(bǔ)充甲醇至原重，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方比例取一定量的輔料，按成品工藝法進(jìn)行制備，得缺三七總皂苷的空白制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察:按擬訂的色譜條件，分別對(duì)供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察:精密稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1對(duì)照品適量，用甲醇溶解并制成每1 mL分別含0.396 mg人參皂苷 Rb1、0.404 mg人參皂苷 Rg1和0.104 mg三七皂苷 R1的對(duì)照品溶液，分別精密吸取溶液 4，8，12，16，20 μL，按擬訂的色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸。人參皂苷 Rb1的回歸方程為 Y=133 059.4 X+5 176.9，r=0.999 7(n=5)，表明其進(jìn)樣量在 1.584～7.920 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;人參皂苷Rg1回歸方程為 Y=178 710.8X-13 382，r=0.999 7(n=5)，表明其進(jìn)樣量在1.616～8.080 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，三七皂苷 R1的回歸方程為 Y=15 780.6 X+5 067.7，r=0.999 0(n=5)，表明其進(jìn)樣量在0.416～2.080 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果人參皂苷 Rg1峰面積的 RSD為1.62%(n=6)，人參皂苷 Rb1峰面積的RSD為1.63%(n=6)，三七皂苷R1峰面積的 RSD為1.48%(n=6)，表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取樣品(批號(hào)為20081101)共5份，精密稱定，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果三七總皂苷含量平均值為83.22 mg/g，RSD為0.58%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品(批號(hào)為20081101)溶液，于室溫下放置 0，12，24，36，72 h 后，按擬訂的色譜條件測(cè)定。結(jié)果人參皂苷Rg1峰面積的 RSD為1.27%(n=5)，人參皂苷Rb1峰面積的 RSD為1.30%(n=5)，三七皂苷 R1峰面積的 RSD為1.77%(n=5)，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)為20081101，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的含量分別為38.733，58.083，10.504 mg/g)0.125 g共6份，分別精密加入0.922 g/L的人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液4，5，6 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由于本試驗(yàn)采用了梯度洗脫，故在加樣回收試驗(yàn)時(shí)選定具代表性的人參皂苷Rg1為指標(biāo)，結(jié)果表明方法加樣回收試驗(yàn)符合要求。

表2 人參皂苷Rg1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取6批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/片)

3 討論

取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1對(duì)照品溶液，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果在203 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故測(cè)定波長(zhǎng)確定為203 nm。使用Aichrom C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)可基本達(dá)到基線分離，但分析時(shí)間較長(zhǎng);而Kromateck C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)能在較短時(shí)間內(nèi)完成分析，基線未能達(dá)到分離。綜合考慮分析時(shí)間、峰形對(duì)稱度及美觀度等因素，選用 Kromateck C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)為分析用色譜柱。

本試驗(yàn)對(duì)超聲處理和回流提取進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩者對(duì)三七總皂總含量的提取效率基本一致，參考藥典及文獻(xiàn)報(bào)道，確定提取方法為超聲處理。對(duì)提取時(shí)間(15，30，45 min)進(jìn)行了考察，結(jié)果超聲30 min時(shí)有最大提取率，而時(shí)間的延長(zhǎng)并不能增大三七總皂苷的提取率，證明超聲30 min已基本提取完全。同時(shí)，對(duì)提取溶劑甲醇、乙醇進(jìn)行篩選，結(jié)果甲醇提取效率均高于其他濃度乙醇溶液，因此選甲醇作為提取溶劑。

[1]WS3-B-1475-93，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第十二冊(cè))[S].

[2]王隸書(shū)，李 陽(yáng)，程?hào)|巖.HPLC法測(cè)定通栓凍干粉針中人參皂苷Rb3的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)研究，2005，11(6):11-12.

[3]王隸書(shū)，程?hào)|巖，董方言.三七葉的HPLC指紋圖譜的研究[J].中成藥，2003，25(2):89-90.

[4]代 龍.HPLC法測(cè)定血塞通分散片中三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Rb1的含量[J]. 齊魯藥事，2009，28(6):333-334.