CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究及治療中的應用進展

廖芳 王光銀

摘要：CRISPR/Cas9基因編輯技術屬于一種基于古細胞抵御外源核算入侵的免疫機制為基礎開發出來的一種新型基因編輯技術，相對于傳統的基因編輯技術而言，CRISPR/Cas9基因編輯技術具備操作簡單、效率高、細胞毒性小等優勢。當前CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤的研究和治療中已經有一定的應用。對此，本文簡要分析CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究及治療中的應用進展，希望能夠為相關工作者提供理論幫助。

關鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯技術;腫瘤;應用進展

引言

惡性腫瘤一直以來都是臨床中致死率最高的疾病，對于人們的生命安全危害顯著。按照國家癌癥中心發布的相關數據來看，我國惡性腫瘤每年新發病例在390萬左右，每年死亡人數約為230萬，并且癌癥負擔也在不斷提升，漲幅在3.9%左右，死亡率漲幅在2.5%左右，對于社會的危害顯著。惡性腫瘤主要是因為遺傳、環境以及機體免疫等方面的因素共同作用而引發，發病機制比較復雜，目前并不明確。另外，惡性腫瘤的治療主要是一放化療、手術治療為主，但是對于放化療的不耐受、晚期患者仍然沒有有效的治療方式，這也是惡性腫瘤患者治愈率不高的主要原因。對此，探討CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究和治療中的應用進展具備顯著實踐性價值。

1.CRISPR/Cas9基因編輯技術

按照核酸內切酶的識別和切割機制的差異，CRISPR/Cas系統可以劃分為2類5型，其中涉及到16個亞型。CRISPRRNA、反式激活CRISPRRNA、Cas9蛋白系統屬于CRISPR/Cas9基因編輯技術的主要構成元素，在外源性DNA第一次入侵噬菌體和細胞時，CRISPR/Cas9系統會特異性的捕獲外緣DNA序列，此時會整合到細菌CIRSPR序列中并形成目標位點下游的建個序列鄰近基序[1]。同一個外緣DNA在第二次進入到細菌時，CRISPR/Cas9轉錄生成前提CRISPRNRA，在RNaseIII的作用之下，可以被加工成為成熟的crRNA。crRNA的3′可以借助堿基互補的方式配對，引導Cas9蛋白快速聚集并形成CRISPR核糖核蛋白復合體。復合體當中crRNA的5′末端特異性識別目標序列，同時還能夠識別PAM的NGG位點。DNA在自我修復期間會優先應用容易失誤的非同源末端連接，錯誤的使用堿基促使DAN發生圖阿扁，從而完成基因敲除目標。在切割期間，PAM位點屬于識別位點，同時PAM位點還可以區別自身DNA和外緣性DNA，預防自身買內衣的識別位點。伴隨著臨床研究的持續深入，研究人員開始應用單鏈導向RNA替代crRNA和tracrRNA并形成R環，同時實現Cas9蛋白對于目標基因的定點切割。

2.CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究和治療中的應用

2.1腫瘤研究

在腫瘤的研究進程當中，應用離題細胞培養的方式實現對腫瘤發病機制的研究非常重要。CRISPR/Cas9基因編輯技術的應用可以為研究者提供一個更加快捷且方便的腫瘤細胞系的分析支持[2]。在早期的相關研究當中，研究者主要是應用Cas9蛋白實現對DNA的靶切除，DNA雙鏈在斷裂之后會出現兩種不同的修復表現，分別為同源末端連接方式與非同源末端連接方式，其中非同源末端連接方式修復之后會出現插入與缺失突變的表現，此時會導致DNA雙鏈發生移碼突變或無意義突變，從而形成基因敲除的目標。某研究應用CRISPR/Cas9基因編輯技術表達載體實現對神經膠質癌細胞的敲除分析，并呈現出高表達的Pyk2，實現對膠質瘤細胞的增值、遷移以及侵襲的表現，所以也證明了CRISPR/Cas9基因編輯技術對于膠質瘤的發生與發展影響，有望成為膠質瘤的治療新方向。為了更好的明確CRISPR/Cas9基因編輯技術的有效性，在拓展CRISPR/Cas9系統其它方面的應用方面，近些年有研究發現了Cas9蛋白的突變體屬于一種喪失了核酸酶禍心的Cas9蛋白，借助和DNA序列的結合可以實現對轉錄過程的抑制，從而實現對基因表達的抑制性影響。這一種表現主要是以dCas9的CRISPR系統別稱為CRISPR干擾技術。該技術主要功能在于兩個方面，一方民事dCas9的介導抑制作用，另一方面是介導激活作用。應用兩種功能可以為研究人員提供敲除基因和探究基因功能的支持，可以借助dCas9實現激活技術篩選以及鑒定原癌基因的表達，有利于新基因治療靶點的研究，可以作為未來腫瘤機制研究的重要方向。

2.2腫瘤治療

在基因修復和敲除方面，腫瘤細胞形成過程中原癌基因的激活和抑制基因的沉默均可以導致腫瘤的發生，在恢復與提升抑癌基因表達方面便成為了治療腫瘤的一個新思路。慢性髓系白血病的發生經常和體內抑癌基因的突變相關，同時也是決定患者預后效果的關鍵。應用CRISPR/Cas9基因編輯技術，可以實現對KBM5細胞當中ASXLI的無效突變修復影響，從而實現對KBM5細胞的增值速率控制，提升細胞的分化表現，并通過ASXLI基因修復實現對癌癥小鼠生存時間的延長。另外，因為表觀遺傳學在腫瘤發生與發展過程中的重要影響，可以借助表觀遺傳學和CRISPR/Cas9基因編輯技術實現對腫瘤發生的影響，所以CRISPR/Cas9基因編輯技術也可能會成為腫瘤治療的新手段。例如，在標貫遺傳銹蝕和dCas9融合以及scRNA招募到目標位點方面，可以借助改變目標位點的甲基化狀態并以特定方式實現對蛋白質的修飾性影響，從而實現腫瘤的治療。

3.總結

綜上所述，CRISPR/Cas9技術在腫瘤研究和治療方面的應用價值顯著，潛力明確。但是，在工作中必須意識到，CRISPR/Cas9技術仍然存在許多無法解決的問題，例如脫靶效應比較突出，在人體應用方面的倫理與安全性問題仍未解決。但是，可以明確CRISPR/Cas9想該技術不斷發展的同時，必然可以解決各個方面的問題，從而有效應用于腫瘤的研究與治療中，提供一個全新的干預路徑，為患者的綜合康復提供幫助。

參考文獻：

[1]張騫，李力.CRISPR/Cas9基因編輯技術在婦科惡性腫瘤研究及治療中應用的進展[J].中華婦產科雜志，2018，53（1）：65-70.

[2]汪超甲，王輝.CRISPR/cas9基因編輯系統的結構功能及其在腦膠質瘤中的應用進展[J].中國醫藥導報，2018，13（18）：244-245.

作者簡介：廖芳（1992.12-）女，湖南漣源人，研究生，單位：婁底職業技術學院，研究方向：生物化學與分子生物學。