基于聚集誘導發光分子的免標記癌胚抗原生物傳感新方法研究

李海銀 常加富 呂文欣 李 峰

(青島農業大學化學與藥學院， 青島 266109)

1 引 言

近年來，大量研究表明，癌胚抗原(CEA)的表達與肺癌、乳腺癌、結直腸癌等眾多疾病相關，被認為是具有臨床診斷價值的腫瘤標志物之一[1,2]。靈敏與準確檢測生物體內CEA的表達對相關疾病的早期診斷與有效治療具有重要的研究價值與現實意義。但是，生物體內CEA的檢測存在表達水平低、干擾物質多等難點，對發展新型高性能的CEA傳感器提出了更嚴格的要求。目前，比色法[3,4]、化學發光法[5,6]、熒光法[7,8]、電化學方法[9,10]、拉曼光譜法[11,12]等技術均已被用于構建CEA傳感器，其中，熒光法因具有簡單、快速、靈敏等優點而備受關注，被認為是實現生物體內CEA靈敏與準確檢測的理想手段。然而，目前報道的CEA熒光生物傳感器面臨很多因素限制：(1)信號單元多為羅丹明、熒光素、青色素、金屬簇等[13～15]，穩定性不佳、發光效率低、抗光學漂白性不強，存在嚴重的聚集誘導淬滅效應; (2)大多數信號分子均需標記[16,17]，該過程需要嚴格控制實驗條件，耗時、費力、復雜、繁瑣，導致探針的構建成本高; (3)碳點與量子點雖可作為信號源實現CEA的免標記熒光檢測[18,19]，但碳點的低發光效率與弱穩定性、量子點的高毒性嚴重限制了其在CEA免標記檢測中的廣泛應用。因此，設計高性能的新型信號分子、發展新型免標記的分析策略，對構建用于檢測生物體內CEA的傳感平臺具有重要意義。

聚集誘導發光(AIE)材料，稀溶液時不發光，聚集態下強烈發光，易于化學修飾剪裁，具有較強的抗光學漂白能力和較高的熒光量子產率，廣泛應用于有機電致化學發光[20]、細胞成像[21]、腫瘤治療[22]、分析傳感檢測[23]等方面，并取得了一系列重要的研究成果。發展以AIE材料作為信號分子的生物傳感平臺有望解決傳統熒光信號分子性能低的關鍵技術難題，極大地提高檢測靈敏度、選擇性與準確性,受到了研究者的廣泛關注。Lu等[24]以AIE材料作為信號源制備了用于檢測K+的熒光探針，并進一步將其用于細胞內K+的原位成像; Zhuang等[25]設計并合成了陽離子AIE染料TPE-Py，基于目標物延長端粒的特性，實現了端粒酶的靈敏、特異性檢測與細胞內原位成像。文獻報道的設計策略主要有兩種：AIE分子與核酸鏈的化學標記、陽離子AIE染料與核酸鏈的靜電吸附。利用靜電吸附策略雖可解決標記的難題，但陽離子AIE染料穩定性差，易受到生物體內陰離子的干擾，降低檢測的準確度。目前，基于AIE材料構建用于CEA分析檢測的傳感平臺未見有文獻報道。

本研究以弱發光的馬來酰亞胺功能化的四苯乙烯(TPE-M)作為信號源，基于酶輔助的循環放大反應，在L-半胱氨酸(L-Cys)存在下，實現了CEA的免標記、高靈敏熒光檢測。L-Cys與TPE-M反應，促使其熒光增強。目標物CEA識別發夾HP，改變其構型，進一步引發聚合酶與內切酶輔助的循環放大反應，生成大量Hemin/G-四鏈體，可催化氧化L-Cys變成胱氨酸(Cys-cys)，而Cys-cys無法與TPE-M反應點亮其熒光。利用CEA加入前后，溶液中不同濃度的L-Cys與TPE-M反應導致的熒光強度的變化，實現體系中目標物的免標記、高靈敏檢測。本研究將AIE材料集成于免標記檢測CEA的生物傳感平臺中，方法簡單、快速、靈敏，具有重要的實際應用價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-4600熒光光譜儀(日本日立公司); Gel Doc XR + 凝膠成像系統(美國伯樂公司)。

Klenow fragment聚合酶(KF聚合酶)、單核苷酸(dNTPs)、RNase抑制劑與三(羥甲基)甲基氨基甲烷(Tris)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。癌胚抗原(CEA)及其干擾物(上海領潮生物科技有限公司); 核酸切割酶Nt.BbvCl(美國新英格蘭生物實驗室); 其它試劑購自上海安耐吉化學公司。Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0，含有10 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2)與1.0 mmol/L二硫蘇糖醇，用于本實驗中DNA溶液的配制。信號分子TPE-M參考文獻[26,27]報道的方法合成，溶于乙腈，制備成濃度為400 μmol/L 的溶液。實驗中所用的核酸片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 本實驗所用核酸序列

2.2 CEA的免標記熒光檢測

將HP溶液在95℃孵育5 min，自然冷卻至室溫，備用。50 μL含有400 nmol/L HP、400 nmol/L P1、1.2 U/μL KF聚合酶、0.8 U/μL Nt.BbvCl、2000 μmol/L dNTPs和不同濃度CEA的溶液在25℃下反應120 min，隨后升溫至90℃反應10 min。冷卻后，向其中加入含有8.0 μmol/L Hemin的50 μL Tris-HCl緩沖溶液，并繼續反應45 min; 接著向其中加入含有200 μmol/L Cys的20 μL Tris-HCl緩沖溶液，反應30 min后，將10 μL TPE-M(400 μmol/L)溶液、70 μL Tris-HCl緩沖溶液與上述反應溶液混合，繼續孵育20 min，進行熒光分析檢測。熒光測量電壓為700 V，激發波長為365 nm，狹縫為5.0 nm，光譜采集范圍為400～650 nm。

3 結果與討論

3.1 TPE-M/L-Cys熒光傳感體系的構建與表征

對制備的TPE-M的熒光性能及TPE-M對L-Cys的熒光響應特性進行了考察。如圖1A所示，受限于馬來酰亞胺結構的強吸電子能力，TPE-M發光較弱，其熒光強度僅為57.60 a.u.。向其中加入L-Cys后，熒光強度大大增加，達到517.3 a.u.。從熒光照片中可更直接地觀察到熒光強度的增加：TPE-M溶液幾乎無熒光，而TPE-M+L-Cys溶液則發射出強烈的天藍色熒光。上述結果均表明，TPE-M對L-Cys有優異的響應性。基于加入L-Cys后TPE-M的熒光強度顯著增加的特性，并參考文獻[28]，推測TPE-M與L-Cys作用機理如圖1B所示：L-Cys分子上的巰基與TPE-M上馬來酰亞胺的雙鍵發生邁克爾加成反應，生成穩定的加成物TPE-M-L，雙鍵被破壞，抑制了分子內的光誘導電荷轉移(PET)，促使熒光增強。

Hemin/G-四鏈體具有類辣根過氧化物酶活性[29,30]，可催化體系中的溶解氧氧化L-Cys為Cys-cys。Cys-cys相對L-Cys而言不含巰基，因此無法破壞TPE-M上馬來酰亞胺的雙鍵增強體系中的熒光信號(圖1C)。基于Hemin/G-四鏈體對L-Cys的催化氧化作用、TPE-M對L-Cys響應以及L-Cys與Cys-cys的分子結構差異，推測TPE-M/L-Cys體系對G-四鏈體DNA有特異的響應性。為驗證此推測，將G-四鏈體DNA(G1)與非G-四鏈體DNA(N1)分別與L-Cys進行預孵育，然后再與TPE-M進行反應，結果如圖1D所示。當G1與N1均不存在時，體系熒光信號較高，且其強度隨預孵育時間變化很小; 當G1存在時，隨著孵育時間延長，熒光強度逐漸降低，在30 min時達到最低值; 當N1存在時，隨著時間延長，檢測體系熒光強度保持穩定，沒有發生變化。實驗結果表明，TPE-M/L-Cys體系可特異性地識別G-四鏈體DNA。

圖1 (A)不同體系的熒光光譜(插圖為相應的熒光照片)：(a)TPE-M，(b)TPE-M + L-Cys; (B)L-Cys與TPE-M的反應路線; (C)Hemin/G-四鏈體對TPE-M/L-Cys作用的示意圖; (D)L-Cys與空白樣品(a)、 G1(b)、 N1(c)預孵育后與TPE-M反應體系熒光強度隨預孵育時間的變化Fig.1 (A) Fluorescent spectra of different systems: (a) maleimide-functionalized tetraphenylethene (TPE-M), (b) TPE-M +L-Cys, and inset is images of (a) and (b) under excitation of 365 nm light; (B) Reaction route of L-Cys and TPE-M; (C) Interaction illustration of TPE-M + L-Cys with hemin/G-quadruplex; (D) FL intensity of the sensing system in the presence of TPE-M versus pre-reaction time between: (a) L-Cys+ blank, (b) L-Cys + G1, and (c) L-Cys + N1

3.2 實驗原理

圖2 基于TPE-M/L-Cys體系免標記、高靈敏檢測 CEA的原理圖Fig.2 Principle of TPE-M/L-Cys based biosensor for carcinoembryonic antigen (CEA) analysis based on target-initiated cyclic amplification reaction

基于上述實驗結果，借助酶輔助的循環放大反應，將TPE-M/L-Cys體系用于檢測CEA，其實驗原理如圖2所示。首先，設計發卡探針HP與模板探針P1序列，以保證目標物存在條件下指數擴增反應的順利進行。HP分為3個部分：Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ，其中，Ⅰ與Ⅱ為CEA的適配體序列，可特異性識別結合CEA; Ⅲ與P1中的Ⅰ*或Ⅱ*互補; Ⅰ與Ⅲ為發卡HP的莖，Ⅱ為發卡HP的環。P1被Nt.BbvCI內切酶識別位點(5′-GCTGAGG-3′)分為3個部分：Ⅰ*、Ⅱ*與Ⅲ*，其中Ⅰ*與Ⅱ*相同，Ⅲ*與G1互補。當目標物不存在時，HP保持發卡構象，與P1 不發生反應(圖3A-a, b, c)，因此無法引發指數擴增反應生成大量Hemin/G-四鏈體，也無法阻止L-Cys與TPE-M反應，故檢測體系發出強烈的熒光信號。當CEA存在時，CEA與HP中Ⅰ與Ⅱ特異性結合形成CEA@HP絡合物，引發HP構象變化，暴露出片段Ⅲ(圖3A-d)。暴露出的片段Ⅲ與模板P1雜交生成新的絡合物，因此，CEA@HP絡合物對應的條帶消失，同時在其后出現一個新的條帶(圖3A-e)。加入KF聚合酶和Nt.BbvCI內切酶后，引發指數擴增反應，合成出大量s1與s2核酸片段，同時釋放出CEA。其中，生成的s1與未反應的P1繼續雜交，釋放的CEA繼續識別未反應的HP，新引發若干個指數擴增反應，生成大量核酸片段s2。因此，在泳道f最前方出現一個新的條帶，與G1條帶的位置相當，進一步證實了富含G堿基的s2核酸片段的生成。在K+與Hemin存在下，s2形成大量Hemin/G-四鏈體，催化氧化L-Cys變成Cys-cys，阻止L-Cys與TPE-M的反應，致使熒光信號降低。

3.3 可行性分析

為驗證所設計的傳感器用于CEA免標記分析檢測的可行性，測定了不同體系的熒光響應(圖3B)。當CEA不存在時，L-Cys與TPE-M反應，產生較強的熒光信號(516.9 a.u.)，其與TPE-M/L-Cys體系的熒光強度相當，表明溶液中存在的DNA片段、生物酶、核苷酸、Hemin等對TPE-M/L-Cys體系的影響非常小。加入10 fmol/L CEA后，體系的熒光強度降低至271.8 a.u.，這主要歸因于CEA引發指數擴增反應生成大量Hemin/G-四鏈體，進而催化氧化L-Cys，阻止其與TPE-M的反應，降低熒光強度。繼續增加CEA濃度至200 fmol/L，熒光強度繼續降低，表現出明顯的負相關關系，進一步證實了實驗原理的可行性：越多的L-Cys引發指數擴增反應生成越多的s2，催化消耗越多的L-Cys，進而大幅度降低熒光信號。上述實驗結果表明，基于TPE-M/L-Cys體系構建免標記傳感平臺用于CEA的熒光分析檢測是可行的。

HP與P1不僅具有識別CEA的功能，同時也有保證指數擴增反應順利進行的作用。因此，利用HP′和P1′分別取代HP和P1構建傳感體系，考察傳感體系對CEA的熒光響應行為(圖3C)。HP′不含有CEA適配體序列，P1′不含有與G1互補的序列。當HP′取代HP后，檢測體系呈現較強的熒光信號，遠大于HP構建的 傳感器檢測到的熒光強度。這主要是因為HP′無法識別CEA，因此構象不發生變化，無法引發循環放大反應產生G-四鏈體，也不能阻止L-Cys與TPE-M的反應。當用P1′代替P1后，檢測體系的熒光信號依然很高，大于P1存在時體系的熒光強度。這主要是因為HP雖可識別CEA引發循環放大反應產生大量核酸片段，但產生的核酸片段不是G-四鏈體DNA，因此無法形成Hemin/G-四鏈體進而阻止L-Cys與TPE-M的反應。因此，合理、巧妙地設計HP和P1的核酸序列才能保證CEA免標記檢測的順利進行。

3.4 實驗條件優化

Hemin/G-四鏈體的產生與CEA的傳感性能相關，因此對影響Hemin/G-四鏈體產生的因素包括HP的濃度、P1的濃度及反應時間進行了優化(圖4A)。隨著發卡探針HP濃度增大，檢測體系熒光強度逐漸減小，在100 nmol/L時達到最低值，因此，最適的HP濃度為100 nmol/L。按照同樣方法進行考察，發現P1的最適濃度為100 nmol/L(圖4B)。如圖4C所示，隨著酶反應時間延長(30～120 min)，熒光強度逐漸降低; 繼續延長酶反應時間(120～180 min)，放大效果增加不明顯。基于此，選擇最佳的酶輔助反應時間為120 min。

圖4 HP用量(A)、 P1用量(B)、 反應時間(C)和不同熱處理(90℃)時間(D)對AIE傳感體系熒光響應的影響， CEA濃度為200 fmol/LFig.4 Effect of HP dosage (A), P1 dosage (B), incubation time (C) and heat-treatment time at 90℃ (D) on fluorescence signal of TPE-M/L-Cys system toward 200 fmol/L CEA

在反應過程中，為了提高酶的活性、減少核酸片段的降解，加入DTT作為強效還原劑。但是，DTT含有自由的巰基，可與TPE-M反應，點亮其熒光，干擾CEA的分析檢測。為消除DTT對傳感體系的干擾，對擴增后的溶液進行90℃熱處理，考察了作用時間對熒光強度的影響(圖4D)。未進行熱處理的體系在CEA存在時仍表現出較強的熒光信號，這主要是因為CEA雖可引發指數擴增反應生成大量Hemin/G-四鏈體，進而消耗L-Cys，阻止其與TPE-M反應，但體系中存在的大量DTT可與TPE-M反應。隨著熱處理時間延長，體系熒光強度逐漸降低，在10 min達到最低值。這表明90℃熱處理10 min，可高效消除檢測體系中存在的巰基化合物，提高檢測的準確度。

3.5 傳感性能分析

在最佳條件下，考察了本傳感器對CEA的檢測性能。如圖5A所示，在0.1～200 fmol/L范圍內，隨著CEA濃度的增加，體系熒光強度逐漸降低。以453 nm處的熒光強度(F453)為縱坐標、CEA濃度的對數(lgCCEA)為橫坐標，繪制工作曲線(圖5B)，結果表明，F453與lgCCEA呈良好的線性關系，線性方程為F453=-128.46 lgCCEA+ 400.69，(R2=0.9965)，檢出限為0.033 fmol/L (S/N=3)。與文獻報道的檢測CEA的方法相比(表2)，本方法靈敏度和檢出限與之相當或更優。

圖5 (A)不同濃度CEA存在下TPE-M/L-Cys體系的熒光光譜; (B)TPE-M/L-Cys體系的熒光強度與CEA濃度的線性曲線Fig.5 (A) Fluorescent curves of TPE-M/L-Cys system in the presence of different concentrations of CEA; (B) Linear relationship of FL signal versus logarithm of CEA concentration

表2 不同CEA檢測方法性能比較

考察了本傳感器對CEA檢測的選擇性。在同樣條件下，采用200 fmol/L的AFP、CA125與CA199進行了驗證。如圖6A所示，當且僅當CEA存在時，檢測體系的熒光信號才大幅度降低，而AFP、CA125與CA199并不能引起體系的熒光強度降低, 這表明HP適配體具有特異性識別CEA的能力。將AFP、CA125、CA199與CEA混合后再進行檢測，檢測體系的熒光信號仍很低，其數值與CEA單獨存在時相當，表明AFP、CA125與CA199的存在并不會對CEA的檢測造成干擾，進一步證實本傳感器具有優異的選擇性與抗干擾能力。

為了驗證構建的AIE傳感器的穩定性，采用同樣方法，在20 μmol/L KNO3、Ca(NO3)2、葡萄糖(Glucose)、甘氨酸(Glycine)、谷氨酸(Glutamic acid)和谷胱甘肽(GSH)存在條件下，檢測200 fmol/L CEA(圖6B)。加入這些干擾物并未對檢測體系的熒光信號產生影響，其原因為90℃熱處理可有效去除巰基化合物，表明本研究構建的AIE傳感器具有優異的穩定性。

圖6 (A)不同分析物(200 fmol/L)存在下TPE-M/L-Cys體系的熒光強度; (B)干擾物對TPE-M/L-Cys體系檢測200 fmol/L CEA強度的影響Fig.6 (A) FL intensity of TPE-M/L-Cys system upon the addition of CEA, α-fetoprotein (AFP), CA125, and CA129, and the mixture of these substances, respectively; (B) FL intensity of TPE-M/L-Cys system toward 200 fmol/L CEA in the presence of 200 μmol/L different substances

3.6 實際樣品分析

利用構建的AIE傳感平臺進行了血清樣品中CEA的檢測，結果見表3。在30%稀釋的血清中，5個加標水平下的回收率分別為97%、 103%、 96%、 104%和105%，相對標準偏差<5%，表明本方法可用于實際樣品中CEA的檢測。

表3 血清樣品中CEA的檢測結果

4 結 論

基于Hemin/G-四鏈體對L-Cys的催化氧化作用、TPE-M對L-Cys響應以及L-Cys與Cys-cys的分子結構差異，結合目標物引發的酶輔助循環放大反應，構建了AIE材料介導的熒光生物傳感器，實現了CEA的免標記、高靈敏檢測。目標分子CEA引發指數擴增反應, 產生大量Hemin/G-四鏈體，催化氧化L-Cys， 阻止L-Cys與TPE-M的反應，進而引起檢測體系的熒光強度變化，實現對CEA的免標記、高靈敏檢測，檢出限低至0.033 fmol/L。同時，此傳感器具有優異的選擇性、穩定性與抗干擾能力，可用于血清中CEA的分析檢測。本研究為建立免標記、靈敏的高性能熒光傳感器提供了參考，拓寬了AIE材料的應用范圍，在臨床醫學診斷領域具有較好的應用前景。