HPLC法同時測定葡萄糖酸氯己定軟膏中雜質和主成分的含量

范 馨 屠寶英 盧碧意（廣東華潤順峰藥業有限公司 佛山 528000）

葡萄糖酸氯己定軟膏是皮膚科用藥類非處方藥藥品。本品主要成分為葡萄糖酸氯己定，主要雜質為對氯苯胺。氯己定為陽離子型表面活性防腐劑，具有廣譜抗菌作用。其作用機制是改變細菌細胞膜的通透性。該產品質量標準依據為WS-10001-（HD-0153）-2002，通過提取后用紫外檢測，該方法操作煩瑣，準確性不強。也沒有對有關物質（例如主要雜質對氯苯胺）的檢驗。

本次實驗研究采用HPLC雙波長檢測法同時測定葡萄糖酸氯己定軟膏中的降解產物對氯苯胺和葡萄糖酸氯己定的含量。該方法專屬性強，精密度好，操作簡便，結果準確可靠。

1 儀器與試劑

1.1 儀器：Agilent 1260II型高效液相色譜儀；Dionex U3000型高效液相色譜儀；Starious十萬分之一天平（賽多利斯科學儀器公司，型號CPA225D）；超純水機（廣州東銳科技有限公司，型號SIMPLICITY185）；超聲波清洗機（新苗，型號 BX3200H）。

1.2 試劑：醋酸氯己定對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100183-201604）；葡萄糖酸氯己定軟膏（廣東華潤順峰藥業有限公司，規格：0.2%，批號：20181101 20180326-2 20180326-3）；對氯苯胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101398-201601）；色譜甲醇（上海星可高純溶劑有限公司，批號：0212180902）；磷酸二氫銨（天津市大茂化學試劑廠，批號：20170109）；冰醋酸（阿拉丁，批號：J1822084）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[Waters XBridge Shield RP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）或效能相當的色譜柱]；以0.14%磷酸二氫銨溶液（用10%磷酸溶液將pH值調至3.5）為流動相A，以色譜甲醇為流動相B，按下表進行線性梯度洗脫，流速為每分鐘1.0 mL，檢測波長分別為244 nm和259 nm，柱溫為35℃。理論板數按對氯苯胺峰計算不低于2000，對氯苯胺峰與相鄰峰的分離度應符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 稀釋液的制備：將80 mL的冰醋酸轉移到1 000 mL量瓶中，倒入色譜甲醇至標線處，搖勻即得

2.2.2 混合對照品溶液的制備：取醋酸氯己定對照品和對氯苯胺對照品適量，加稀釋液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含葡萄糖酸氯己定0.1 mg（按每1 g的醋酸氯己定相當于1.435 g的C22H30Cl2N10·2C6H11O7計算）、對氯苯胺 0.25 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備：取軟膏2.5 g（約相當于葡萄糖酸氯己定5 mg），精密稱定，置50 mL量瓶中，加入稀釋液約30 mL，置80℃水浴中加熱，小心振搖使葡萄糖酸氯己定溶解，放冷，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻2 h以上，取出后迅速濾過，續濾液放冷，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液：按樣品的處方比例和工藝制備缺葡萄糖酸氯己定的陰性樣品，再按“2.2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 各溶液色譜行為：葡萄糖酸氯己定軟膏各溶液的色譜圖見圖1、圖 2。

由圖1、圖2可知：對照品溶液位上的目標檢測峰與空白溶劑對比，沒有干擾峰。對樣品，空白基質進行酸堿破壞，光線破壞，氧化破壞，高溫破壞后，主峰附近雜質峰與主峰分離度符合要求，空白基質、空白溶劑主峰出峰時間處均無干擾峰。該方法專屬性強。2.4線性關系考察：試驗工作曲線繪制：取醋酸氯己定對照品和對氯苯胺對照品適量，加稀釋液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含葡萄糖酸氯己定1 mg、對氯苯胺2.5 μg的溶液，作為儲備液。分別取貯備液 0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL 至10 mL的容量瓶中，分別用稀釋液溶解并稀釋至刻度，得線性溶液。精密量取對照品線性溶液20 μL注入液相色譜儀，按照“2.1”中的洗脫梯度進行洗脫，記錄色譜圖。以待測成分濃度為X軸，峰面積為Y軸，作線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍

2.5 準確度（回收率）：分別精密量取含葡萄糖酸氯己定0.1 mg/mL、對氯苯胺0.25 μg/mL的混合對照品溶液4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，加入含2.5 g空白基質的50 mL容量瓶中，按“2.2.3”項下的方法制成相當于原含量80%、100%、120%的供試品溶液。依法測定，結果見表3。

表3

2.6 精密度與重復性：取同一混合對照品溶液，重復進樣6次，測定葡萄糖酸氯己定和對氯苯胺的峰面積RSD分別為0.5%和1.8%（n=6），表明儀器精密度良好；取同一批號樣品（批號：20181101），稱取6份，按2的測定方法測定。結果葡萄糖酸氯己定的平均標示含量為95.14%，RSD為1.4%；對氯苯胺的平均標示含量為0.063%，RSD為2.3%，表明本方法重復性良好。

2.7 穩定性：取同一混合對照液和樣品溶液，分別于室溫下在24 h內，觀察溶液性狀，是否有變色沉淀等異常現象，并在3、6、9、12、15、18、21 h進樣，記錄峰面積，混合對照液中氯己定和對氯苯氨峰面積RSD分別為0.4%、0.8%。樣品溶液中氯己定和對氯苯氨峰面積RSD分別為0.5%、3.1%。兩種溶液的性狀均無異常，表明混合對照液和樣品溶液在21 h內穩定。

2.8 結論：綜上所述，通過采用高效液相色譜法特定的流動相組成以及線性梯度洗脫程序，實現對葡萄糖酸氯己定的含量和有害物質對氯苯胺的含量同時測定。可以準確檢測有害物質對氯苯胺的含量，加樣回收率在95%以上。可以準確檢測葡萄糖酸氯己定的含量加樣回收率，在98%～103%之間。

3 討論

目前，葡萄糖酸氯己定軟膏的國家標準依據為WS-10001-（HD-0153）-2002，含量測定時用醋酸氯己定為對照品，計算時再折算。我們也以醋酸氯己定為對照品。將醋酸氯己定的乙醇溶液[濃度為10（g/mL）]在 200～300 nm 的波長處掃描可知，醋酸氯己定在259 nm的波長處有最大吸收。另取對氯苯胺的乙醇溶液[濃度為0.25（g/mL）]在200～300 nm的波長處掃描可知，對氯苯胺在244 nm的波長處有最大吸收。通過各相鄰波長的對比實驗可知，對氯苯胺的測定波長以239 nm、242 nm、244 nm比較合適；氯己定以257 nm、259 nm、260 nm比較合適。流動相的選擇：以磷酸二氫鉀和磷酸二氫銨溶液為水相，區別不大；但有機相若更換為色譜乙腈，氯己峰的出峰時間會大大提前，約13 min，而且峰分叉；洗脫梯度的選擇：磷酸鹽與色譜甲醇在25～35 min的時間段為氯己定峰的時間段，此時兩者的比例以（75∶25）至（45∶55）均可以，但當磷酸鹽的比例達60%時，氯己定不能正常出峰。色譜柱的選擇：由于提取液呈酸性，所以選擇酸性柱。對該方法做耐用性考察，用了三個品牌的色譜柱，雖然出峰時間有所不同，但分離效果均相近，表明該檢測方法有較好的適用性。