0.01%硫酸阿托品滴眼液對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼部的安全性評(píng)價(jià)研究△

肖云峰盛惟劉劍（.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心呼和浩特000；2.內(nèi)蒙古盛唐國(guó)際蒙醫(yī)藥研究院有限公司 呼和浩特 00000；3.包頭朝聚眼科醫(yī)院 包頭 04060）

包頭朝聚眼科醫(yī)院在內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市開(kāi)展了為期80余天的青少年眼健康篩查工作。經(jīng)過(guò)調(diào)研發(fā)現(xiàn)小學(xué)生近視發(fā)病率達(dá)24.76%，初中生近視發(fā)病率達(dá)50.7%，高中生近視發(fā)病率達(dá)55.87%[1]。

當(dāng)今世界青少年越來(lái)越不注重用眼衛(wèi)生，加之日常生活中的電腦、手機(jī)使青少年用眼負(fù)荷過(guò)早增大，導(dǎo)致近視眼成為發(fā)病率最高的眼病之一[2-5]。如何預(yù)防和治療青少年近視成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)[6，7]。1%硫酸阿托品擴(kuò)瞳作用強(qiáng)，擴(kuò)瞳后恢復(fù)較慢，一般患者不愿長(zhǎng)時(shí)間使用。0.01%硫酸阿托品滴眼液阿托品含量適中，對(duì)睫狀肌麻痹作用弱，視近物不模糊，且對(duì)瞳孔無(wú)散大，對(duì)青少年近視有一定的恢復(fù)作用[8-10]。本研究為促進(jìn)臨床安全使用0.01%硫酸阿托品滴眼液提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，清潔級(jí)，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（蒙）2015-0001。新西蘭大耳白兔，體質(zhì)量1.7～2.1 kg，普通級(jí)，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（蒙）2015-0001。

1.2 受試藥物及主要試劑：0.01%硫酸阿托品滴眼液（包頭朝聚眼科醫(yī)院，批號(hào)20190909）；0.05%硫酸阿托品注射液（天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號(hào)201904081）；0.9%氯化鈉注射液（貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)E118052804）；無(wú)水乙醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20190627）；大鼠丙二醛（MDA）ELISA檢測(cè)試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號(hào)20190901003）；大鼠總超氧化物歧化酶（T-SOD）ELISA檢測(cè)試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號(hào)20190901008）；大鼠谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）ELISA檢測(cè)試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號(hào)20191009005）；大鼠過(guò)氧化氫酶（CAT）ELISA檢測(cè)試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號(hào)20191008008）；熒光素鈉（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)L03A10H94500）；硫化鈉（NaS）（天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號(hào) 20180530）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號(hào)BS2202S）；低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)SIGMA公司，型號(hào)3K15）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號(hào)CICI-PI-150FEL）；實(shí)體解剖顯微鏡（德國(guó)Leica公司，型號(hào)DFC 290）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Fisher公司，型號(hào) Multiskan MK3）；schiotz眼壓計(jì)（蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司，型號(hào)YZ7A）；裂隙燈顯微鏡（蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司，型號(hào)YZ5G）；微量移液器（美國(guó)Thermo Fisher公司，型號(hào)F2）；攝像機(jī)（日本索尼公司，型號(hào)HDR-PJ820E）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 視網(wǎng)膜光線異常敏感試驗(yàn)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按性別、體重將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射劑）、供試品組（0.01%硫酸阿托品滴眼劑）和對(duì)照高劑量組（0.05%硫酸阿托品注射劑），共3組，每組20只，雌雄各半。

2.1.2 強(qiáng)光損傷視網(wǎng)膜模型的建立：強(qiáng)光損傷視網(wǎng)膜的模型采用手術(shù)聯(lián)合光照箱法建立。在光照箱的六個(gè)面分別安裝4根15W的白色LED燈管（Philips），光照箱上方安裝通風(fēng)孔，光照箱下方為密集的通風(fēng)孔，光照箱內(nèi)安放兩個(gè)體積為48 cm×24 cm×25 cm有機(jī)玻璃透明箱。大鼠正常活動(dòng)時(shí)，大鼠眼球水平的各箱壁照度均大于2740 lux，光照箱內(nèi)的平均溫度控制在18℃～24℃，換氣次數(shù)≥15次/h。模型建立前的所有大鼠在每天12 h明（20～50 lux）以及12 h暗（0～12 lux）的循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)10 d。第11天，將大鼠逐只放入玻璃乙醚麻醉缸中麻醉，麻醉后的大鼠使用角針和4#不可吸收縫合線在其眼瞼中部與鼻側(cè)皮膚處縫一針，使其無(wú)法閉眼。待大鼠清醒后逐只將其放入光照箱，持續(xù)接受照度大于2740 lux的光照射3 h。3 h光照后拆除眼瞼縫合線，將大鼠送回正常環(huán)境中。

2.1.3 給藥及取材：模型建立后對(duì)3組大鼠進(jìn)行給藥。空白對(duì)照組大鼠每眼給予0.9%氯化鈉注射劑0.05 mL，供試品組大鼠每眼給予0.01%硫酸阿托品滴眼劑0.05 mL，對(duì)照高劑量組大鼠每眼給予0.05%硫酸阿托品注射劑0.04 mL，開(kāi)合眼瞼使受試物與大鼠眼球充分接觸。給藥24 h后，將大鼠進(jìn)行乙醚麻醉，股動(dòng)脈放血處死。迅速小心摘取大鼠雙側(cè)眼球，于實(shí)體解剖顯微鏡下，用眼科鑷夾住視神經(jīng)側(cè)，使用鋒利的刀片劃開(kāi)角膜，沿鋸齒緣剪掉角膜。將眼球放入生理鹽水，小心剝離視網(wǎng)膜與眼球后壁，摘下視網(wǎng)膜，用濾紙吸去視網(wǎng)膜表面液體。將雙側(cè)視網(wǎng)膜，放入1 mL生理鹽水，充分研磨制成勻漿，-4℃3 500 r/min離心10 min，取上清液，冷凍分裝。按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，測(cè)定視網(wǎng)膜中MDA、T-SOD、GSH-PX 和CAT含量。

2.2 眼壓檢測(cè)試驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取健康新西蘭大耳白兔9只，雄性。家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體重將兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射劑）、供試品組（0.01%硫酸阿托品滴眼劑）和對(duì)照高劑量組（0.05%硫酸阿托品注射劑），共3組，每組3只。

2.2.2 給藥及數(shù)據(jù)采集：試驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，空白對(duì)照組家兔左眼給予0.9%氯化鈉注射劑0.1 mL，供試品組家兔左眼給予0.01%硫酸阿托品滴眼劑0.1 mL，對(duì)照高劑量組家兔左眼給予0.05%硫酸阿托品注射劑0.08 mL，家兔右眼均不做處理。受試物滴入后，開(kāi)合眼瞼使其與家兔眼球充分接觸，保證藥物充分暴露。在給藥后 1、2、4、24、48 和 72 h，使用 schiotz眼壓計(jì)測(cè)定家兔雙側(cè)眼壓并記錄。

2.3 急性眼刺激性試驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取健康新西蘭大耳白家兔15只，雄性，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，適應(yīng)性期間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行體重測(cè)定和臨床癥狀觀察。給藥前24 h用帶磨鈍的8號(hào)注射針頭的注射器在兔兩側(cè)眼下穹窿部結(jié)膜處滴入2滴無(wú)菌的2%熒光素鈉溶液，1～2 min后觀察，黃綠色的染色可顯示角膜上皮缺損的部位及范圍，同時(shí)，使用裂隙燈對(duì)家兔雙眼結(jié)膜損傷情況進(jìn)行檢查，剔除眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結(jié)膜損傷的兔后，留取9只。按體重將這9只兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射劑）、供試品組（0.01%硫酸阿托品滴眼劑）和對(duì)照高劑量組（0.05%硫酸阿托品注射劑），共3組，每組3只。

2.3.2 試驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)：采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。24 h內(nèi)滴眼給藥4次（間隔8 h），空白對(duì)照組家兔左眼結(jié)膜囊給予0.9%氯化鈉注射劑0.1 mL，供試品組家兔左眼結(jié)膜囊給予0.01%硫酸阿托品滴眼劑0.1 mL、對(duì)照高劑量組家兔左眼結(jié)膜囊給予0.05%硫酸阿托品注射劑0.08 mL，滴入后開(kāi)合眼瞼使受試物與兔眼球充分接觸，保證藥物充分暴露，右眼不做處理。最后一次給藥后 1、2、4、24、48、72 h，再次對(duì)家兔進(jìn)行眼刺激反應(yīng)情況檢查。連續(xù)觀察21 d，每天對(duì)家兔雙眼進(jìn)行檢查，每次檢查都詳細(xì)記錄兔眼部異常反應(yīng)，根據(jù)眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算眼刺激反應(yīng)分值，判斷眼刺激程度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 視網(wǎng)膜光線異常敏感試驗(yàn)：各受試物組大鼠視網(wǎng)膜中MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT的含量進(jìn)行組間比較，均無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)果表明，0.01%硫酸阿托品對(duì)視網(wǎng)膜光線異常敏感試驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笠暰W(wǎng)膜中MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT含量無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 受試物對(duì)視網(wǎng)膜光線異常敏感試驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笠暰W(wǎng)膜中MDA、TSOD、GSH-PX 和 CAT 含量的影響（±s，n=20）Tab.3 Effects of the test substance on the retinal light abnormality test model rats MDA，T-SOD，GSH-PX and CAT contents（±s，n=20）

表3 受試物對(duì)視網(wǎng)膜光線異常敏感試驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笠暰W(wǎng)膜中MDA、TSOD、GSH-PX 和 CAT 含量的影響（±s，n=20）Tab.3 Effects of the test substance on the retinal light abnormality test model rats MDA，T-SOD，GSH-PX and CAT contents（±s，n=20）

組別 M D A（m m o l/g p r o t）T-S O D（U/m g H b）G S H-P X（U/m g p r o t）C A T（U/m g p r o t）空白對(duì)照組供試品組對(duì)照高劑量組1 0 9.3 6±5.9 6 1 1 4.8 6±8.2 3 1 0 6.1 8±1 1.1 2 3 3 5.1 3±2 9.1 0 2 9 6.0 1±2 3.1 7 3 1 8.7 7±3 1.2 8 6 4 3.9 9±6 6.8 1 6 7 3.4 5±4 1.5 9 6 7 7.7 4±3 4.6 9 1 5 2 6.5 1±1 2 7.7 8 1 5 1 9.0 1±1 1 6.0 4 1 5 2 8.5 5±1 3 5.5 1

3.2 眼壓檢測(cè)試驗(yàn)：結(jié)果顯示，所測(cè)得給藥后家兔眼壓均在家兔眼壓正常值范圍內(nèi)。結(jié)果表明，受試物對(duì)家兔眼壓無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Eye irritation response score criteria

表2 眼刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation criteria for eye irritation

表4 受試物對(duì)家兔眼壓的影響Table 4 Effects of test substances on intraocular pressure in rabbits

3.3 急性眼刺激性試驗(yàn)：根據(jù)表3、表4，對(duì)家兔給藥期間及觀察期觀察顯示，受試物對(duì)家兔眼角膜、結(jié)膜、虹膜均未造成損傷，眼部未發(fā)生水腫反應(yīng)，同時(shí)，眼部也并未因給藥而出現(xiàn)分泌物增多、分泌物黏稠等癥狀，結(jié)果表明，受試物未對(duì)家兔眼部給藥部位產(chǎn)生刺激性。

4 討論

0.01%硫酸阿托品滴眼液對(duì)視網(wǎng)膜光線異常敏感試驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笠暰W(wǎng)膜中的MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT等內(nèi)源性物質(zhì)的含量無(wú)影響；0.01%硫酸阿托品滴眼液滴眼給藥后對(duì)家兔眼壓無(wú)影響；0.01%硫酸阿托品滴眼液對(duì)家兔眼部不產(chǎn)生刺激性，不損傷家兔眼部角膜、結(jié)膜、虹膜等組織器官，不會(huì)誘發(fā)家兔眼部水腫反應(yīng)。