基于基因芯片技術對椎間盤退變關鍵基因鑒定分析

李勝吾，蔚浩，戴國鋼

(四川省骨科醫院，四川成都 610041)

腰痛是臨床常見病和多發病，嚴重影響人們的生活質量并帶來較大的經濟負擔[1-4]。大量研究發現，腰痛主要病因是椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration,IDD)[2, 5]。IDD發生率隨著年齡的增長而增加，60歲以上無癥狀者中，90%會出現IDD[6]。研究發現，IDD涉及遺傳、機械和生物等多因素。然而，其確切機制尚未完全闡明。

2015年，Kazezian等[7]使用基因芯片獲得纖維環(annulus fibrosus,AF)和髓核(nucleus pulposus,NP)的基因表達譜。在本研究中，為了深入了解IDD的分子機制，筆者基于生物芯片數據鑒定了退行性AF和退行性NP與非退行性同類組織中的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。本研究還收集了8名IDD患者和8名健康志愿者的全血(whole blood,WB)進行生物芯片信息分析，以確定IDD患者WB中的DEGs，并且用實時熒光定量PCR驗證了部分DEGs。

1 資料與方法

1.1 椎間盤生物芯片數據

基于Affymetrix GPL17810平臺(HG-U133_Plus_2)的芯片數據集GSE70362從基因表達綜合數據庫下載而來(網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。該數據集包含24個髓核和24個AF的尸體組織樣本基因表達數據，由36位年齡21-82歲捐贈者提供。本研究下載了原始信號強度數據的CEL格式文件和IDD的湯普森分級信息[8]。我們將原始的探針名轉換為基因名，丟棄任何未被識別的探針。對于具有多個探針的基因，只有具有最高差異倍數的探針被保留。在24個NP和24個AF樣本中，各有8個湯普森一級或湯普森一至二級的樣本被認為是非退變性的，各有16個分類為湯普森二至五級的樣本被認為是退變性的。

1.2 識別AF和NP的DEGs

使用Genespring GX 11.5軟件(美國安捷倫科技公司生產)識別DEGs。使用RMA(Robust multi-array average)算法對原始數據進行預處理，配對t檢驗的閾值P值為0.05，差異倍數(fold change,FC)為1.5，以鑒定退行性和非退行性AF、NP樣本之間的DEGs。對于具有多個探針的基因，只保留具有最高FC的探針。

1.3 人類WB采集

WB樣本于2018年4月～2018年8月在四川省骨科醫院采集。本研究招募了8名患者，其中4名男性和4名女性，年齡33～60歲，經磁共振成像確診為椎間盤退變(DD)；另有8名志愿者，其中4名男性和4名女性，年齡19～23歲，沒有下腰痛或坐骨神經痛的臨床證據。在上午7:00～7:30之間，從每位受試者的左肘正中靜脈抽取10 mL的空腹全血。所有WB樣本立即置于靜脈真空采血管全血RNA管(美國BD)中于-20℃保存，72 h內送上海博豪生物科技有限公司進行基因芯片雜交。

1.4 WB的基因芯片數據分析和WB-DEGs的鑒定

基因芯片數據分析使用安捷倫SurrPress G3人類基因表達生物芯片8×60 K在上海博豪生物科技有限公司的安捷倫基因芯片掃描儀平臺上進行掃面分析，遵循安捷倫科技有限公司(美國加利福尼亞州)的標準操作流程。利用R語言的limma包對芯片掃描得到的原始數據進行歸一化處理。采用分位數算法，對信號值進行Log2歸一化處理。t檢驗的閾值P值為0.05，FC值為1.5，以鑒定WB-DEGs。對于具有多個探針的基因，只保留具有最高FC的探針。WB基因表達譜的完整數據集已上傳到GEO數據庫，GSE124272。

1.5 常見DEGs總RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量PCR檢測

用實時熒光定量PCR檢測NP、AF和WB中常見DEGs的表達。按照說明，使用PX血液RNA提取試劑盒(美國OMEGA)提取和純化總RNA。使用逆轉錄反應試劑盒(日本TOYOBO)將每個RNA樣品逆轉錄為cDNA，隨后用cDNA進行實時熒光定量PCR。基因表達水平的量化使用7500HT序列檢測系統(美國ABI)和Power SYBR Green PCR Master Mix預混液(美國ABI)。用引物表達法(v3.0.1)設計特異基因的引物，由上海生丁生物工程股份有限公司合成。以β-肌動蛋白基因為內參基因，用2?傆bΔCt方法將基因表達水平與β-肌動蛋白基因進行歸一化。

1.6 統計學分析

實時熒光定量PCR數據由均值±標準差表示。使用GraphPad Prism 6.0軟件(美國加利福尼亞州圣地亞哥GraphPad軟件有限公司生產)進行t檢驗。P<0.05 認為有統計學意義。

2 結果

2.1 DEGs

AF、NP、WB三組差異表達基因概況如表1所示。三組22個共同的差異表達基因。

表1 AF、NP、WB中DEGs概況

2.2 常見DEGs的實時熒光定量PCR

用WB進行蛋白二硫鍵異構酶A4(protein disulfide isomerase family A member 4, PDIA4)、肽基脯氨酰順反異構酶11(FK506 BINDING PROTEIN 11, FKBP 11)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 4, ENPP4)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)和肌動蛋白結合蛋白LIM1(actin binding LIM protein 1, ABLIM1)實時熒光定量PCR驗證基因芯片雜交結果。用WB進行的實時熒光定量PCR結果與基因芯片雜交結果一致，證明了基因芯片結果的可靠性(圖1 A-E)。椎間盤退變(IDD)患者WB中PDIA4、FKBP11和ENPP4的表達水平明顯低于健康志愿者，而SOD2的表達水平明顯高于健康志愿者。結果表明，PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2的基因表達水平在患者組和志愿者組之間存在顯著差異(P<0.05)。PCR引物均列于表2中。

圖1 PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2、ABLIM1在椎間盤退變(IDD)患者與健康志愿者WB中表達水平比較

表2 用于實時熒光定量PCR的引物序列

3 討論

基因芯片技術目前已逐漸被運用于椎間盤退變領域的相關研究，為椎間盤退變的發病機制研究起到重要的推動作用[9]。以往的研究大多集中在退行性和非退行性AF或NP或整個椎間盤組織之間的DEGs方面，而這些組織只能通過手術獲得。本研究通過全血分析出退變椎間盤患者與健康人之間存在DEGs，且這些差異基因與AF和NP的差異基因既有部分重疊，也有差異，這一結論提示，今后在椎間盤退變相關疾病生物學治療上，不能只局限于椎間盤局部組織的取樣和分析，還要考慮不同組織的基因表達可能存在差異。全血與椎間盤組織存在共同的DEGs，在條件有限情況下，可以優先選擇操作更為簡便的抽血進行取樣分析。

本研究鑒定出846個AF-DEGs、902個NP-DEGs和862個WB-DEGs，其中有22個共同的DEGs。用實時熒光定量PCR驗證椎間盤退變患者全血中PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2、ABLIM1基因的表達水平，PDIA4、FKBP11和ENPP4的表達水平明顯低于健康志愿者，而SOD2的表達水平明顯高于健康志愿者。

Schubert等[10]通過全基因組表達分析鑒定了5個AF和6個NP生物標志物，但在本研究的全血中未觀察到這11個生物標志物的異常表達。Guo等[11]比較退行性椎間盤和非退行性椎間盤的基因表達譜，發現有35個FC大于2的DEGs在AF-DEG和NP-DEG間重疊。在這35種常見的DEGs中，只有具有LIM結構域的鋅指蛋白185包含在本研究FC為1.5的DEGs中。Kazezian等[12]鑒定了17個FC大于1.5的退變AF生物標記物，但在本研究所鑒定出的AF-DEGs中未觀測到這些生物標志物的異常表達。Zhang等[13]比較椎間盤退變患者外周血單核細胞與非椎間盤退變者外周血單核細胞的基因表達譜，共鑒定出62個DEGs，其中上調基因39個，下調基因24個，在這39個上調的DEGs中，人膜聯蛋白A3(Annexin A3)、組織蛋白酶抗菌肽(cathelicidin antimicrobial peptide, CAMP)和白介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)在本研究中椎間盤退變患者全血里有所上調，但細胞周期調控蛋白Cyclin B1和肌間蛋白2(Myomesin 2, MYOM2)表達有所下調，在我們所鑒定出的WB-DEGs中沒有發現他們研究報道的24個下調基因。

隨著對椎間盤退變機制的認識深入和分子生物學技術不斷進步，基因治療在改變椎間盤細胞代謝和生物力學性能方面逐漸開展。基因治療的目的是將外源性 DNA或 RNA轉染至靶細胞，通過外源基因表達對靶細胞有利的蛋白產物或沉默特定基因減少有害產物生成，使靶細胞恢復正常的形態功能[14]。

本研究發現椎間盤退變患者全血中差異基因PDIA4、FKBP11和ENPP4的表達水平明顯降低，而SOD2的表達水平明顯增高，通過國內外文獻數據庫查閱，目前尚無PDIA4、FKBP11和ENPP4與椎間盤退變相關性的研究報道。PDIA4屬于蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族，PDI家族主要在促蛋白折疊、翻譯后修飾上發揮重要作用，與未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)密切相關，而UPR與多種疾病如糖尿病、神經退行性疾病、腫瘤等發生發展密切相關，PDIA4主要在細胞內質網中表達，目前對于PDIA4生理學功能研究并不透徹[15]。FKBP11是肽基脯氨酸順異異構酶家族成員之一，也與UPR密切相關，可保護細胞免受炎性反應損傷[16]，炎性反應在椎間盤退變的發生和發展中起重要作用[17-20]。筆者推測FKBP11可能在椎間盤退變中參與炎癥保護。ENPP4的生物學功能也尚不明確，有研究報道其在巨噬細胞內表達，具有抗腫瘤效應和保護細胞降低細胞毒性反應[21]。關于SOD2與椎間盤退變的關系，目前已有一定的研究進展。椎間盤退變是伴隨著氧化性損傷和炎性反應而加速的衰老過程[22-24]。椎間盤退變過程中，血管向椎間盤內生長[25-26]，由此形成的新生血管使椎間盤的無血管組織暴露于高氧張力[27]。SOD2將超氧自由基轉化為H2O2，通過抗氧化劑酶將其分解為無害的H2O和O2[28-29]。過度的氧化反應通過誘導細胞因子和趨化因子表達可引起蛋白質、DNA和細胞膜損傷，與細胞炎性反應相關[30-31]。SOD2在椎間盤退變過程中可能通過抗氧化和抗炎機制保護椎間盤。

本研究發現，人全血中的PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2是椎間盤退變的潛在標志物，這些基因可能對椎間盤退變的機制研究和生物學治療提供了重要的依據。今后需要開展進一步研究以確定這些基因在椎間盤退變過程中的具體作用機制。由于椎間盤退變與年齡密切相關，為了盡量避免椎間盤退變可能出現在健康對照組，本研究招募了年輕人作為志愿者，不排除年齡可能會影響基因表達檢測結果，因此需要后續研究再次驗證。