miR?203調(diào)控鋅指蛋白281表達(dá)對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖、遷移的影響

陳小波 豆倩影 黃立新

南陽(yáng)市中心醫(yī)院整形外科，河南473000

微小RNA?203（miR?203）作為一種抑癌基因在惡性黑素瘤中低表達(dá)，可調(diào)控黑素瘤細(xì)胞增殖、遷移過(guò)程［1］。鋅指蛋白281（zinc finger protein 281，ZNF281）是鋅指蛋白的一種亞型，在惡性腫瘤或癌變細(xì)胞中高表達(dá)，有誘發(fā)腫瘤的作用［2］。研究［3］表明，miR?203 可抑制鋅指蛋白217 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，降低其致癌性。miR?203是否可調(diào)節(jié)黑素瘤中ZNF281蛋白水平，從而影響黑素瘤細(xì)胞的增殖及遷移目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14為研究對(duì)象，探討miR?203對(duì)A375、M14細(xì)胞增殖、遷移的影響，并初步探討其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供一定參考。

一、材料與方法

1.細(xì)胞系及主要試劑：人血管內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304、人黑素瘤細(xì)胞系M14（上海賓穗生物科技有限公司，批號(hào)分別為BSC?5107481307?01、BSC?504847958?01）；人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、SK?MEL?28、SK?MEL?2（上海名勁生物科技有限公司，批號(hào)分別為CM?1030、CM?1813、CM?1811）。

miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第1 鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）［天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)分別為DP501、FP401、FP205?02］；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、miR?203 模擬物、miR?203模擬物陰性對(duì)照、miR?203抑制劑、miR?203抑制劑陰性對(duì)照（廣州銳博生物科技有限公司，批號(hào)分別為P0309、P0716、P0703、P5047、P3066）；CCK8 試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號(hào)C0037）；草酸銨結(jié)晶紫染色液（上海博谷生物科技有限公司，批號(hào)PT007）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、一抗ZNF281（抗兔）、內(nèi)參GAPDH（抗兔）、二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab228530、ab101318、ab181602、ab205718）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：各培養(yǎng)基添加胎牛血清制成含10%胎牛血清培養(yǎng)基4 ℃?zhèn)溆谩CV304、SK?MEL?28 細(xì)胞用RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，A375、M14 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，SK?MEL?2 細(xì)胞用MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，均置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)85%時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)。收集各組細(xì)胞檢測(cè)miR?203 水平，采用與ECV304 差異較大的A375、M14細(xì)胞系進(jìn)行下一步研究。

3.實(shí)驗(yàn)分組及處理：生長(zhǎng)良好的A375、M14細(xì)胞稀釋成2×104個(gè)/ml，分別接種于24孔板中，每孔500 μl，待細(xì)胞密度達(dá)50%時(shí)轉(zhuǎn)染。按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，實(shí)驗(yàn)分5組：對(duì)照組（細(xì)胞正常培養(yǎng)）、miR?203模擬物對(duì)照組（加入50 nmoL/L miR?203 模擬物陰性對(duì)照）、miR?203 抑制劑對(duì)照組（加入50 nmoL/L miR?203 抑制劑陰性對(duì)照）、miR?203 模擬物組（加50 nmoL/L miR?203 模擬物）、miR?203抑制劑組（加50 nmoL/L miR?203抑制劑）。各組細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)miR?203 表達(dá)水平：收集細(xì)胞，miRNA 提取分離試劑盒提取總RNA（200 ng），用miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒合成cDNA，PCR儀擴(kuò)增miR?203、內(nèi)參U6。miR?203 正向引物序列：5′?TGCTC TGAGGCGTCTAAGGCGTCCG?3′，反向引物序列：5′?CCCAA GCTTCACCTCCCAGCAGCACTTG?3′；內(nèi)參U6 正向引物序列：5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，反向引物序列：5′?AAC GCTTCACGAATTTGCGT?3′。反應(yīng)體系（20 μl）：50 mg/L cDNA 1 μl，10 μmol/L 正向/反向引物各0.5 μl，SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μl，雙蒸水8 μl。反應(yīng)條件：95 ℃3 min，95 ℃10 s，61 ℃45 s，40 個(gè)循環(huán)。2－??Ct法計(jì)算細(xì)胞中miR?203 水平，??Ct=?Ct目的基因－?Ct內(nèi)參。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

5.Western 蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中ZNF281 水平：收集細(xì)胞，添加蛋白裂解液，4 ℃10 000×g離心20 min，吸取上清液，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白總濃度。每孔上樣25 ng，聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，280 mA 轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對(duì)應(yīng)加入一抗ZNF281（稀釋比例1/5 000）、內(nèi)參GAPDH（1/5 000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1.5 h。蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。蛋白表達(dá)相對(duì)值=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

6. CCK8 法檢測(cè)miR?203 對(duì)A375、M14 細(xì)胞增殖能力的影響：各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，稀釋成1 × 105個(gè)/ml，每孔100 μl 置于96 孔板中，分別于0、24、36、48、60、72 h 添加CCK8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀450 nm 處檢測(cè)吸光度（A450），只添加培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照，A450=A450實(shí)驗(yàn)孔－A450空白對(duì)照孔。

7. Transwell 檢測(cè)miR?203 對(duì)A375、M14 細(xì)胞遷移能力的影響：調(diào)整細(xì)胞為5 × 103個(gè)/ml，每孔500 μl 接種于Transwell 小室中，培養(yǎng)48 h；取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，流動(dòng)蒸餾水清洗，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，每個(gè)小室5 個(gè)不重復(fù)視野計(jì)數(shù)并取平均值為該組細(xì)胞遷移數(shù)量。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

8. 雙熒光素酶鑒定miR?203 與ZNF281 的靶向關(guān)系：TargetScan 軟件（http：//www.targetscan.org/vert_72/）查找ZNF281 mRNA 的3′UTR 與miR?203 結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)合成ZNF281 的3′UTR 野生型（3′UTR?WT）和3′UTR 突變型（3′UTR?MUT），分別與miR?203模擬物或miR?203模擬物陰性對(duì)照（miR?203 NC）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR?203 NC+3′UTR?WT組、miR?203模擬物+3′UTR?WT 組、miR?203 NC+3′UTR?MUT 組、miR?203模擬物+3′UTR?MUT組熒光素酶活性。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK?q法。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.血管內(nèi)皮細(xì)胞系和黑素瘤細(xì)胞系miR?203表達(dá)水平比較：各細(xì)胞系中miR?203 表達(dá)水平不同（F = 39.501，P <0.05）。A375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2 中miR?203 表達(dá)（0.23±0.02、0.34±0.06、0.48±0.09、0.56±0.11）均顯著低于ECV304（1.01 ± 0.21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q = 9.057、7.514、5.682、4.650，均P<0.05）。因此，選miR?203 表達(dá)量差異較大的黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14進(jìn)行下一步研究。

2.血管內(nèi)皮細(xì)胞系和黑素瘤細(xì)胞系ZNF281 表達(dá)水平比較：各細(xì)胞系中ZNF281 表達(dá)水平不同（F = 35.701，P <0.001）。A375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2中ZNF281蛋白表達(dá)（0.87±0.15、0.79±0.06、0.80±0.12、0.43±0.11）均顯著高于ECV304（0.29 ± 0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q =8.794、14.434、9.311、2.737，均P<0.05）。見(jiàn)圖1。

3. 各組A375、M14 細(xì)胞miR?203 表達(dá)的情況：與對(duì)照組、miR?203 模擬物對(duì)照組、miR?203 抑制劑對(duì)照組相比，miR?203 模擬物組miR?203 水平較高（A375：q = 23.902、24.610、25.623；M14：q=7.595、7.183、7.321），miR?203 抑制劑組miR?203 水平較低（A375：q = 10.985、11.425、15.669；M14：q = 13.717、10.445、8.665），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見(jiàn)表1。

4. miR?203 對(duì)A375、M14 細(xì)胞增殖的影響：36、48、60、72 h，與對(duì)照組、miR?203 模擬物對(duì)照組、miR?203 抑制劑對(duì)照組相比，miR?203模擬物組A375、M14細(xì)胞增殖水平降低（A375：q36h= 6.311、9.417、7.564，q48h= 6.225、4.583、4.407，q60h= 3.775、4.457、3.997，q72h= 2.725、2.456、2.305，M14：q36h= 4.085、5.991、5.114，q48h= 6.171、7.652、5.353，q60h=5.465、5.571、4.603，q72h= 4.351、4.830、4.719，均P < 0.05），miR?203 抑制劑組細(xì)胞增殖水平升高（A375：q36h= 3.037、2.790、2.975，q48h= 3.676、3.001、4.740，q60h= 2.623、2.509、2.600，q72h= 2.622、2.615、2.409，M14：q36h= 2.421、2.327、2.378，q48h= 2.622、3.181、2.559，q60h= 2.410、2.278、2.096，q72h=2.056、1.926、1.887，均P<0.05）。24 h 時(shí)，miR?203 模擬物組A375、M14細(xì)胞增殖水平顯著低于對(duì)照組、miR?203模擬物對(duì)照組、miR?203 抑制劑對(duì)照組（A375：q = 7.217、6.341、4.692，M14：q=4.656、6.114、4.974，均P<0.05）；miR?203 抑制劑組M14 細(xì)胞增殖水平顯著高于對(duì)照組、miR?203模擬物對(duì)照組及miR?203 抑制劑對(duì)照組（q = 5.289、5.661、4.426，均P<0.05），而miR?203 抑制劑組A375 細(xì)胞增殖水平與這3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)圖2。

組別對(duì)照組miR?203模擬物對(duì)照組miR?203抑制劑對(duì)照組miR?203模擬物組miR?203抑制劑組F值P值miR?203 A375 1.00±0.13 0.98±0.12 1.02±0.09 3.41±0.21a b c 0.39±0.04a b c 487.632<0.001 M14 1.01±0.06 1.03±0.11 0.99±0.13 2.05±0.33a b c 0.45±0.08a b c 68.454<0.001遷移數(shù)量（個(gè)）A375 35.48±4.38 36.84±5.41 37.16±6.13 19.36±4.61a b c 69.52±5.95a b c 70.193<0.001 M14 42.62±4.51 43.16±5.61 45.16±8.65 29.52±5.69a b c 75.16±8.31a b c 37.350<0.001 ZNF281 A375 1.12±0.21 1.16±0.19 1.12±0.23 0.86±0.15a b c 2.15±0.21a b c 37.514<0.001 M14 0.76±0.13 0.82±0.19 0.73±0.21 0.47±0.08a b c 1.01±0.25 6.826<0.001

5.miR?203 對(duì)A375、M14 細(xì)胞遷移的影響：與對(duì)照組、miR?203 模擬物對(duì)照組、miR?203 抑制劑對(duì)照組相比，miR?203 模擬物組A375、M14 細(xì)胞遷移數(shù)量較低（A375：q =6.209、6.024、5.685，M14：q = 4.420、4.181、3.700，均P <0.05），而miR?203 抑制劑組A375、M14 細(xì)胞遷移數(shù)量較高（A375：q = 11.286、9.954、9.279，M14：q = 8.340、7.818、6.126，均P<0.05）。見(jiàn)表1。

6.miR?203對(duì)A375、M14細(xì)胞中ZNF281蛋白表達(dá)的影響：miR?203 模擬物組A375、M14 細(xì)胞中ZNF281 蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組、miR?203模擬物對(duì)照組及miR?203抑制劑對(duì)照組（A375：q=2.468、3.036、2.319，M14：q=4.654、4.159、2.834，均P<0.05）。miR?203抑制劑組A375細(xì)胞顯著高于對(duì)照組、miR?203 模擬物對(duì)照組及miR?203 抑制劑對(duì)照組（q=8.495、8.563、8.101，均P<0.05），而miR?203 抑制劑組M14細(xì)胞與對(duì)照組、miR?203模擬物對(duì)照組、miR?203抑制劑對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q = 2.173、1.482、2.101，均P >0.05）。見(jiàn)表1、圖3。

圖4 miR?203 與ZNF281 的靶向關(guān)系 miR?203 與ZNF281 存在15 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在靶向位點(diǎn)連續(xù)結(jié)合的10 個(gè)位點(diǎn)建立ZNF?281突變序列（ZNF?281?MUT）

7.初步分析miR?203與ZNF281的靶向關(guān)系：TargetScan初步預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR?203 與ZNF281 之間存在靶位點(diǎn)見(jiàn)圖4。根據(jù)靶向位點(diǎn)連續(xù)結(jié)合的10個(gè)位點(diǎn)建立ZNF?281突變型。熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者的靶向關(guān)系顯示，miR?203 NC+3′UTR?WT 組（1.00±0.17）、miR?203模擬物+3′UTR?WT 組（0.48 ± 0.06）、miR?203 NC + 3′UTR?MUT 組（0.96 ±0.13）、miR?203 模擬物+ 3′UTR?MUT 組熒光素酶活性（0.98 ± 0.15）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 20.950，P < 0.001）。與miR?203 NC + 3′UTR?WT 組相比，miR?203 模擬物+ 3′UTR?WT組細(xì)胞熒光素酶活性下降（q=7.065，P<0.05）。

三、討論

目前，治療惡性黑素瘤的常用方法為手術(shù)治療，無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療的部分患者多采用放化療，但效果不佳且有不良反應(yīng)，因此尋找安全、有效的治療方法是當(dāng)前的臨床熱點(diǎn)。miR?203存在于染色體的不穩(wěn)定脆性區(qū)域，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)皮膚特異性miRNA，其在轉(zhuǎn)移性黑素瘤及黑素瘤細(xì)胞系中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR?203 可抑制黑素瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、集落形成以及血管生成誘導(dǎo)能力；在體內(nèi)，miR?203還抑制異種移植腫瘤生長(zhǎng)，并減少淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移；可作為黑素瘤的有效抑制劑［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2中miR?203表達(dá)水平顯著低于血管內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304，提示miR?203水平降低可能與惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)；A375、M14 細(xì)胞中，上調(diào)miR?203表達(dá)可降低細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞遷移數(shù)量，下調(diào)其表達(dá)可增加細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞遷移數(shù)量，表明miR?203 可調(diào)控A375、M14細(xì)胞增殖及遷移過(guò)程，抑制其表達(dá)可降低黑素瘤細(xì)胞增殖及遷移活性。

ZNF可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成，抑制細(xì)胞凋亡、自噬及溶酶體生成等，介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展［5］。ZNF217高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織中，且與結(jié)直腸癌患者的低生存率有關(guān)，而miR?203可通過(guò)抑制ZNF217表達(dá)降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲活性，從而緩解癌癥進(jìn)展［3］。抑制ZNF281 基因表達(dá)可降低直腸癌細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且可增加及氟尿嘧啶化療敏感性［6］。環(huán)狀RNA circAGFG1 可與miR?203 競(jìng)爭(zhēng)性地調(diào)控ZNF281 表達(dá)，通過(guò)circAGFG1/miR?203/ZNF281軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移［7］。ZNF281作為DNA結(jié)合蛋白，在腫瘤中研究較少，目前尚未見(jiàn)ZNF281在黑素瘤中的相關(guān)報(bào)道。本研究顯示，黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2中ZNF281 蛋白表達(dá)顯著高于血管內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304，提示ZNF281可能與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。下調(diào)A375、M14細(xì)胞miR?203 表達(dá)，可引起ZNF281 蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖活性及遷移細(xì)胞數(shù)均降低；上調(diào)A375細(xì)胞miR?203表達(dá)，引起ZNF281 蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖活性及遷移細(xì)胞數(shù)增加，提示miR?203 可能通過(guò)調(diào)控ZNF281 蛋白表達(dá)，影響黑素瘤細(xì)胞的增殖和遷移。M14細(xì)胞中，上調(diào)miR?203表達(dá)可引起細(xì)胞增殖活性升高、遷移細(xì)胞數(shù)增加，但ZNF281 蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，可能與ZNF281蛋白受多種調(diào)控及不同黑素瘤細(xì)胞系的特性有關(guān)。進(jìn)一步采用雙熒光素酶鑒定miR?203與ZNF281的靶向關(guān)系顯示，miR?203與ZNF281之間存在靶位點(diǎn)，miR?203 可能直接調(diào)控ZNF281。本研究只初步研究了兩個(gè)黑素瘤細(xì)胞系中miR?203 與ZNF281 的關(guān)系及其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的影響，還應(yīng)進(jìn)一步通過(guò)上調(diào)或下調(diào)ZNF281表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步探索miR?203 調(diào)控惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突