小標(biāo)本二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細(xì)胞

胡天星 余南嵐 楊海潮 朱琳 楊希川

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，重慶400038

毛乳頭是位于毛囊基底部的特殊間質(zhì)成分，在毛囊發(fā)育和周期性再生調(diào)控中起主導(dǎo)作用，毛乳頭細(xì)胞功能異常是導(dǎo)致毛囊周期失衡和脫發(fā)的主要起始因素［1?2］。因此，體外培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞是深入研究毛囊生物學(xué)和各種與毛發(fā)相關(guān)的功能代謝疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)［3?4］。但頭皮標(biāo)本獲取困難，同時(shí)毛乳頭位置隱蔽，分離與培養(yǎng)困難，嚴(yán)重限制了毛囊生物學(xué)的研究和發(fā)展。我們改良建立了一種簡單、高效、易操作且高質(zhì)量分離和培養(yǎng)小標(biāo)本人頭皮毛乳頭細(xì)胞的方法，為進(jìn)一步研究毛囊生物學(xué)提供細(xì)胞來源支持。

一、材料

1. 主要試劑：胎牛血清（德國PAN?Biotech 公司），DMEM/高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone 公司），0.6%分離酶Ⅱ、0.2%膠原酶Ⅳ（美國Sigma?Aldrich公司），一抗鼠抗人層黏連蛋白單克隆抗體、Ⅳ型膠原多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），牛血清白蛋白（美國Genview公司），二抗3H-吲哚菁類染料標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液、二甲基亞砜（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、青-鏈霉素溶液（以色列Biological Industries公司）。全培養(yǎng)基由10 ml血清、1 ml青-鏈霉素溶液、98 ml DMEM/高糖培養(yǎng)基配制。

2.標(biāo)本來源和保存：2018 年9 月至2019 年1 月在陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科收集3例頭部色素痣、6例皮脂腺痣切除術(shù)廢棄的含毛皮膚標(biāo)本。其中，1例皮脂腺痣位于輕度雄激素性禿發(fā)區(qū)，標(biāo)本大小為0.5 cm × 0.5 cm ～0.5 cm×1 cm。標(biāo)本采集后立即置4 ℃無菌生理氯化鈉溶液中保存，保存時(shí)間<12 h。所有標(biāo)本采用小標(biāo)本二步酶消化法分離毛乳頭，1例色素痣和1例皮脂腺痣標(biāo)本同時(shí)還采用一步酶消化法進(jìn)行處理。本研究經(jīng)解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)KY201977）。

二、方法

1. 標(biāo)本消毒：在無菌培養(yǎng)皿中用75%乙醇浸泡標(biāo)本3 遍，每次3 min，4 ℃無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3 次后，移入裝有PBS的無菌培養(yǎng)皿中。

2.小標(biāo)本二步酶消化法分離毛乳頭：①用鑷子夾住標(biāo)本，脂肪面朝上，用眼科剪盡量去除多余皮下脂肪組織，直至顯露毛球部，剪下毛根部，置4 ℃無菌PBS中；②用鑷子從毛根部分離出單個(gè)含毛球部的毛囊，轉(zhuǎn)入含0.6%分離酶Ⅱ的培養(yǎng)皿中，37 ℃消化30 min，待毛干從結(jié)締組織層分離出（圖1A）；③去除培養(yǎng)皿中的分離酶，加0.2%膠原酶37 ℃消化30 ～60 min，此后每20 min 觀察毛乳頭游離情況，當(dāng)包裹毛乳頭的結(jié)締組織層開始松散，毛乳頭快要游離時(shí)立即加入3 倍體積的全培養(yǎng)基終止消化；④反復(fù)緩慢吹打3 ～5 次培養(yǎng)基，使毛乳頭從結(jié)締組織中釋放出來，離心（1 000 r/min，5 min，離心半徑15.5 cm，下同）、棄上清液，沉淀為毛乳頭、毛干、結(jié)締組織等混合物，用1 ml 全培養(yǎng)基重懸沉淀物并移入培養(yǎng)皿中，加3 ml DMEM/高糖培養(yǎng)基反復(fù)緩慢沖洗，用移液槍去除懸浮的毛干、殘發(fā)及部分可見纖維組織；⑤繼續(xù)低速離心（500 r/min，5 min）3次、棄上清液，用1 ml全培養(yǎng)基重懸沉淀物，移入無菌60 mm培養(yǎng)皿中，補(bǔ)齊3 ml全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

一步酶消化法：參考文獻(xiàn)［5］的方法分離。

3.毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)：將分離獲得的毛乳頭用全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后首次觀察毛乳頭貼壁情況，此后每12 h 觀察1 次。當(dāng)所有貼壁的毛乳頭開始遷出，進(jìn)行第1 次半量換液，此后每隔24 h 半量換液1 次。計(jì)算毛乳頭分離率（分離毛乳頭數(shù)/毛囊數(shù)×100%）、貼壁率（貼壁毛乳頭數(shù)/分離毛乳頭數(shù)×100%），記錄毛乳頭細(xì)胞遷出時(shí)間。

待細(xì)胞完全遷出后重懸，去除原培養(yǎng)基，加0.25%胰蛋白酶1.5 ml，37 ℃消化1 min，鏡檢可見毛乳頭邊緣部細(xì)胞變圓，中心部細(xì)胞趨于圓形，鏡下室溫消化1 ～2 min，待中心部大部分細(xì)胞變圓后，去除胰蛋白酶，立刻加入1 ml全培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞至完全脫落形成單細(xì)胞并均勻分布在培養(yǎng)基中，補(bǔ)齊3 ml全培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即為原代毛乳頭細(xì)胞。

4.毛乳頭細(xì)胞傳代：將原代毛乳頭細(xì)胞重懸后培養(yǎng)，融合約90%后及時(shí)進(jìn)行傳代，去除原培養(yǎng)基，加0.25%胰蛋白酶1.5 ml，37 ℃消化1 min，鏡檢可見部分細(xì)胞開始變圓，鏡下室溫消化1 ～2 min，待80%細(xì)胞變圓后，立刻加入1 ml全培養(yǎng)基終止消化，用移液器吹打細(xì)胞至完全重懸，移入無菌離心管離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加2 ml 培養(yǎng)基重懸，按1∶2比例傳代，補(bǔ)齊3 ml全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即為第1代毛乳頭細(xì)胞。

5. 毛乳頭細(xì)胞的鑒定：取第3 代毛乳頭細(xì)胞，按每皿1 ×105個(gè)接種到激光共聚焦小皿上，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞密度約70%時(shí)，4%多聚甲醛室溫固定20 min。PBS 漂洗3 次，0.5% Triton X?100 室溫通透20 min，PBS漂洗3次，每次5 min。5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，棄封閉液加入一抗4 ℃過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，加二抗室溫避光孵育30 min，PBS 漂洗3 次，每次10 min，DAPI 復(fù)染核，95%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

6.毛乳頭細(xì)胞凍存：取第3 ～4代處于對數(shù)生長期的毛乳頭細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集于離心管中離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加900 μl胎牛血清重懸，緩慢加入100 μl 二甲基亞砜移入凍存管，4 ℃放置30 min，-80 ℃過夜，最后于液氮中保存。

7. 毛乳頭細(xì)胞復(fù)蘇：向15 ml 無菌離心管中加2 ml 全培養(yǎng)基，取凍存細(xì)胞，37 ℃水浴融化后轉(zhuǎn)入離心管離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加1 ml全培養(yǎng)基重懸，移入培養(yǎng)皿中，補(bǔ)齊3 ml 全培養(yǎng)基置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)胞貼壁生長情況。

三、結(jié)果

1.毛乳頭分離：小標(biāo)本二步酶消化法分離的頭皮毛乳頭鏡下呈倒梨形，形態(tài)完整，部分可見殘留真皮鞘（圖1B），毛乳頭分離率為60.8%±2.1%。而一步酶消化法未分離出毛乳頭。毛乳頭細(xì)胞分離方法比較見表1。

項(xiàng)目標(biāo)本大小毛囊處理消化方法收集方法總操作時(shí)間實(shí)際操作時(shí)間毛乳頭分離率（n=77）毛乳頭貼壁率（n=47）一步酶消化法0.5 cm×0.5 cm ～0.5 cm×1 cm剪碎被脂肪包裹的毛囊部0.2%膠原酶Ⅳ37 ℃消化4 ～5 h顯微鏡下拾撿6.0 ～8.0 h 2.0 ～3.0 h小標(biāo)本二步酶消化法0.5 cm×0.5 cm ～0.5 cm×1 cm剪下整塊毛球部，分離單個(gè)毛囊0.6%分離酶Ⅱ37 ℃消化30 min；0.2%膠原酶Ⅳ37 ℃消化30 ～60 min低速離心收集（500 r/min，5 min，離心半徑為15.5 cm）2.0 ～3.0 h 1.0 ～1.5 h 60.8%±2.1%33.7%±7.0%a改良二步酶消化法［6］>0.5 cm×1 cm剪取毛乳頭組織，分離毛囊0.5%分離酶4 ℃消化6 ～8 h；0.2%膠原酶D 37 ℃消化4 h離心收集（2000 r/min，5 min，離心半徑為15.5 cm）≥10.0 h≥2.0 h約40%約30%b 00

2.毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)：小標(biāo)本二步酶消化法分離出的毛乳頭接種12 h 后出現(xiàn)貼壁，24 h 后貼壁的毛乳頭即有大量細(xì)胞遷出，剛遷出的細(xì)胞呈短梭形（圖1C）；48 h后細(xì)胞進(jìn)一步遷出，細(xì)胞質(zhì)豐富，呈長梭形（圖1D）；60 h后細(xì)胞大面積遷出，初步呈聚集生長（圖1E）；72 h后細(xì)胞基本遷出完成，隨著細(xì)胞大量增殖，靠近毛乳頭中心位置遷出的細(xì)胞呈多層聚集生長現(xiàn)象（圖1F）。小標(biāo)本二步酶消化法毛乳頭細(xì)胞12 h 貼壁率為33.7%±7.0%，72 h 貼壁率為86.6%±3.9%，細(xì)胞遷出時(shí)間0.5 ～3.0 d，實(shí)驗(yàn)總操作時(shí)間2.0 ～3.0 h，減去消化等待時(shí)間，實(shí)際操作時(shí)間1.0 ～1.5 h。

3.毛乳頭細(xì)胞傳代：用上述方法傳代后，第2代毛乳頭細(xì)胞24 h 后即可見細(xì)胞貼壁生長，傳代的毛乳頭細(xì)胞重新呈凝集性生長趨勢（圖1G）。48 h后凝集性生長愈發(fā)明顯。但隨傳代次數(shù)的增加，該細(xì)胞特有的凝集性生長趨勢會(huì)逐漸消失，第9代細(xì)胞不再出現(xiàn)凝集性生長現(xiàn)象（圖1H）。

4.免疫熒光鑒定毛乳頭細(xì)胞：頭皮毛乳頭細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Ⅳ型膠原和細(xì)胞層黏連蛋白（圖2）。

5.毛乳頭細(xì)胞復(fù)蘇：復(fù)蘇的細(xì)胞狀態(tài)良好，48 h后開始呈現(xiàn)明顯的凝集性生長狀態(tài)（圖1I）。

四、討論

毛乳頭是位于毛囊基底部特殊的間質(zhì)成分，具有強(qiáng)烈的蛋白合成與旁分泌特征，毛乳頭細(xì)胞具有凝集性生長特性［7］，其最顯著的功能特點(diǎn)是誘導(dǎo)毛囊形成及再生［8］。體外分離培養(yǎng)頭皮毛乳頭細(xì)胞是研究毛囊的前提和基礎(chǔ)。然而，頭皮標(biāo)本來源有限，大多為頭部手術(shù)后的廢棄組織，能獲得的標(biāo)本較小，且單個(gè)標(biāo)本所含毛囊數(shù)通常<20個(gè)。目前頭皮毛乳頭細(xì)胞的分離方法主要包括顯微解剖法和酶消化法。盡管顯微解剖法中毛乳頭獲得率高，但獲得的毛乳頭貼壁率低、細(xì)胞遷出慢，且需特殊的體視顯微鏡，對操作人員的技術(shù)要求高，勞動(dòng)強(qiáng)度大，且耗時(shí)長、效率低；一步酶消化法簡便、易操作，但標(biāo)本需求量大，且對毛囊質(zhì)量要求高［9?10］。毛囊質(zhì)量與能否成功分離培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞有密不可分的關(guān)系，毛囊質(zhì)量與患者年齡、毛發(fā)質(zhì)量及術(shù)后廢棄部位均有關(guān)［11］。這些因素均限制了人頭皮毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)。因此，我們改良建立了小標(biāo)本二步酶消化法，對分離、培養(yǎng)、保存小標(biāo)本人頭皮毛乳頭細(xì)胞有重要意義。

小標(biāo)本二步酶消化法操作簡單、高效，0.6%分離酶Ⅱ37 ℃消化30 min 可實(shí)現(xiàn)毛乳頭與毛囊上皮在基底膜的分離，0.2%膠原酶Ⅳ37 ℃下作用30 ～60 min可消化毛乳頭周圍的膠原纖維、脂肪組織和結(jié)締組織等［12］，在分離酶和膠原酶的交替作用下通過500 r/min低速離心能夠最大限度地將毛乳頭從毛囊中分離出來，減少毛乳頭的損傷和損失。對于毛囊質(zhì)量不高的雄激素性禿發(fā)患者脫發(fā)區(qū)的毛囊用此方法也能成功分離出毛乳頭，并培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞。免疫熒光顯示分離的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Ⅳ型膠原和細(xì)胞層黏連蛋白，可鑒定為毛乳頭細(xì)胞［6］。與人頭皮毛乳頭細(xì)胞的改良二步酶消化法［6］和一步酶消化法［5］相比較，小標(biāo)本二步酶消化法可明顯縮短毛乳頭分離時(shí)間，提高毛乳頭分離率和貼壁率，縮短毛乳頭細(xì)胞的遷出時(shí)間，提高低質(zhì)量毛囊分離成功率（表1）。本研究中一步酶消化法未分離出毛乳頭，原因可能是獲取的標(biāo)本小、毛囊質(zhì)量差且數(shù)量少，初步處理標(biāo)本的過程中，毛囊可能被破壞。

我們改良建立的小標(biāo)本人頭皮毛乳頭細(xì)胞二步酶消化法既具有顯微解剖法的低毛乳頭損失優(yōu)點(diǎn)，又具有一步酶消化法操作簡單等特點(diǎn)，同時(shí)具備耗時(shí)短、對標(biāo)本要求低等優(yōu)點(diǎn)，是一種較為理想的小標(biāo)本分離培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞的方法，具有推廣和應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突