N-myc 下游調控基因2 蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及對人喉表皮樣癌細胞生物學特性的影響

趙謙，白艷霞，張少強，李宏慧，姚小寶，戴皓，邵淵

喉鱗狀細胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，發病率高居所有頭頸部鱗狀細胞癌的第二位［1］。近年來，隨著早期診斷及治療手段的大幅進步，多種腫瘤相關致死率逐年下降［2-3］。但是，喉鱗狀細胞癌病人的死亡率卻無顯著改善［4-5］。喉鱗狀細胞癌的復發及進展是一個多因素、多階段的過程，其病因涉及環境及基因等多方面原因。然而，喉鱗狀細胞癌發生及進展的潛在分子機制研究成果較少。因此，鑒定喉鱗狀細胞癌診斷及判斷預后分子標志物，探索其余臨床治療及預后的相關性具有很高的價值。N-myc下游調控基因 2（N-myc，downstream regulated gene 2，NDRG2）近年來在國內首次克隆并報道并確定為潛在的抑癌分子［6］，NDRG2的過表達可顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移能力［7-8］。但是截至目前，NDRG2在喉鱗狀細胞癌細胞的生物學特性尚無報道。本研究擬應用體內及體外實驗的方法來研究NDRG2對喉鱗狀細胞癌發生、發展的相關性。

N-myc 下游調控基因2 蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及對人喉表皮樣癌細胞生物學特性的影響

圖1 N-myc下游調控基因2（NDRG2）在癌旁組織（1A、1B）及喉鱗狀細胞癌（1C、1D）中的表達（HE×200）：1A、1C為陰性，1B、1D為陽性圖4 N-myc下游調控基因2（NDRG2）抑制Hep-2細胞轉移能力（HE×200）：4A為對照組，4B為NDRG2抑制喉鱗狀細胞癌轉移圖5 N-myc下游調控基因2（NDRG2）抑制Hep-2細胞侵襲能力（HE×200）：5A為對照組，5B為NDRG2抑制喉鱗狀細胞癌侵襲插圖10-1

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1臨床標本 41 例喉鱗狀細胞癌組織及癌旁組織于2014年1月1日至2017年12月31日在西安交通大學第一附屬醫院接受喉部分切除術的病人，其中男性37例，女性4例，年齡范圍52～78歲，中位年齡63.7 歲。按TNM 分期，T1 有15 例（36.6%），T2有 12 例（29.3%），T3 有 10 例（24.4%），T4 有 4 例（9.8%）。組織標本切除后經4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋、切片、儲存于西安交通大學第一附屬醫院病理科。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》關要求。

1.1.2實驗試劑及儀器 免疫組化染色試劑盒購自福州邁新科技有限公司，QPCR 試劑盒購自日本TAKARA 公司，DEME 培養基購自美國 Gibco 公司，胎牛血清購自北京賽澳美細胞技術有限公司，兔抗人NDRG2抗體購自英國Abcam公司，羊抗兔二抗購自美國CST公司，NDRG2過表達慢病毒由上海吉凱科技有限公司設計并包裝，Transwell 小室購自美國Millipore公司，基質膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化染色（Immunohistochemestry，IHC）喉鱗狀細胞癌及癌旁組織石蠟切片常規脫蠟，高壓抗原修復，3%過氧化氫阻斷非特異性過氧化物酶，5%非免疫血清封閉，兔抗人NDRG2抗體一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗三次后，羊抗兔二抗室溫避光孵育20 min，PBS清洗三次后，鏈霉菌抗生物素-過氧化酶染色20 min，PBS 清洗三次后，DAB 顯色，蘇木素復染，PBS 反藍，水性封片劑封片，顯微鏡拍照檢測。免疫組化評分根據染色強度及陽性染色范圍進行綜合評估。染色強度為藍色計0分，淡黃色計1分，黃色計2 分，棕褐色計3 分。陽性染色范圍5%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，76%～100%計4 分。兩者乘積大于等于4 分判定為NDRG2陽性，乘積小于4分判定為NDRG2陰性。

1.2.2實時定量聚合酶鏈式反應（Quantitative realtime Polymerase Chain Reaction，QPCR）配置QPCR反應液：10 xbuffer 2μL，NDRG2或β-actin正義鏈引物1μL，NDRG2或β-actin反義鏈引物1μL，反轉錄模板2 μL，去離子水14 μL。程序設定為預變性95 ℃ 2 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 60 ℃ 15 s，延伸72 ℃，35 個循環；4 ℃。NDRG2 正向引物序列：5’-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3’，NDRG2 反向引物序列：5’-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3’；β-actin正向引物序列：5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’；β-actin 反向引物序列：5’-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’。

1.2.3細胞培養及慢病毒感染 喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞及正常鼻咽上皮NP-69細胞購自于上海吉凱基因化學技術有限公司，培養基為10%胎牛血清的DEME培養液，細胞孵箱條件設置為：37 ℃，5%二氧化碳濃度。細胞鋪6孔板，匯合度至40%左右時，行慢病毒感染實驗。更換為1 mL無血清培養液，加入2μL NDRG2過表達或對照病毒及5μLEnhanced Infection Solution，感染12 h后更換為完全培養基。72 h后行Transwell檢測兩組細胞侵襲及轉移能力的差異。

1.2.4蛋白質印跡法（Western Blot）提取感染NDRG2過表達及對照慢病毒組細胞蛋白，蛋白定量后，添加6x上樣緩沖液，煮沸5 min，每孔加20μg蛋白樣品。跑膠，電泳條件設定為恒壓110 V，時間70 min。轉膜至PVDF 膜，轉膜條件設定為恒流300 mV，時間70 min。5%BSA 孵育 1 h，兔抗人NDRG2一抗（1∶800 稀釋）4 ℃過夜孵育，TBST 清洗3 次后，羊抗兔二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST清洗三次后，化學發光，拍照。

1.2.5Transwell 無血清培養基重懸感染 NDRG2過表達及對照病毒的Hep-2細胞，接種200μL共計60 000 個細胞至Transwell 小孔，每組設3 個副孔。其中細胞侵襲實驗所用Transwell 小孔預先包被基質膠，細胞轉移試驗所用Transwell 小孔無需預先處理。將小室置于已加入600 μL 20%血清濃度DMEM培養基的24孔板中。24 h后，無水甲醇固定10 min，PBS清洗后，0.1%結晶紫染色10 min，PBS清洗，顯微鏡下拍照。

1.3 統計學方法所有數據均采用SPSS 22.0軟件包進行分析。計量資料以±s表示，兩組間差異分析采用獨立樣本雙側t檢驗；不同臨床病理特征分組間NDRG2 陽性率差異分析采用χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NDRG2在喉鱗狀細胞癌組織中的表達如圖1所示，喉鱗狀細胞癌及癌旁組織中NDRG2免疫組化陽性染色主要定位于細胞質，伴輕微胞核和胞膜陽性染色。41例喉鱗狀細胞癌組織中NDRG2陽性率為24.39%（10/41），癌旁組織中NDRG2陽性率為85.37%（35/41），差異有統計學意義（χ2=30.781，P=0.001）。

表1 N-myc下游調控基因2（NDRG2）陽性率在不同臨床病理特征比較/例（%）

2.2 NDRG2 與喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系卡方分析顯示TNM III 和V 期喉鱗狀細胞癌的NDRG2陽性率顯著低于TNM I 和II期病人，淋巴結轉移喉鱗狀細胞癌病人中NDRG2 陽性率亦低于未發生轉移病人（P＜0.05，表1）。其他臨床病理特征分組間NDRG2 陽性率差異無統計意義。以上結果提示NDRG2可能參與抑制喉鱗狀細胞癌淋巴轉移。

2.3 NDRG2在Hep-2細胞中的表達QPCR及WB結果顯示NDRG2 mRNA 及蛋白在喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞中的表達水平為1.193±0.053明顯低于正常鼻咽上皮NP-69 細胞（0.238±0.072）（t=3.536，P=0.036）。提示NDRG2 可能在喉鱗狀細胞癌中扮演抑癌分子的角色。見圖2。

圖2 NDRG2在喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞中的表達

2.4 NDRG2 過表達慢病毒對NDRG2 表達的影響為了檢測NDRG2對Hep-2細胞侵襲及轉移的影響，我們包裝了NDRG2 慢病毒。QPCR 及WB 結果顯示感染NDRG2慢病毒的Hep-2細胞（1.046±0.048）中NDRG2 mRNA 及蛋白表達水平較感染對照病毒的Hep-2細胞（5.878±0.483）均明顯升高（t=4.825，P=0.017），見圖3。

圖3 NDRG2慢病毒可上調Hep-2細胞中NDRG2表達

2.5 NDRG2對Hep-2細胞轉移能力的影響Transwell 實驗結果顯示，感染NDRG2 過表達慢病毒組轉移細胞數目明顯低于感染對照病毒組［Lv-control（141.328±23.424）個，Lv-NDRG2（54.925±16.825）個；t=4.413，P=0.023］，提示NDRG2 可抑制喉鱗狀細胞癌細胞轉移。見圖4。

2.6 NDRG2對Hep-2細胞侵襲能力的影響Tran-swell 實驗結果顯示，感染NDRG2 過表達慢病毒組侵襲細胞數目明顯低于感染對照病毒組（Lv-control（71.782±18.675）個，Lv-NDRG2（25.931±9.729）個，t=3.757，P=0.031），提示NDRG2 可抑制喉鱗狀細胞癌細胞侵襲。見圖5。

3 討論

喉癌是頭頸部的惡性腫瘤，近年來發病率不斷升高，每年約增加25%，且生存預后差，嚴重危害人們的生活質量，喉鱗狀細胞癌占喉癌發病人群的95%。關于喉鱗狀細胞癌的發生機制方面的研究為臨床的基因治療提供了依據。NDRG2 是N-myc 的下游基因，又被稱為分化相關基因，在組織中的表達水平隨著發育、生長的過程不斷的發生變化，NDRG2 基因對組織的生長、分化發揮著重要的作用。自NDRG2 發現以來，眾多研究均證實NDRG2在包括喉鱗狀細胞癌在內的多種腫瘤組織中表達下調，是公認的抑癌分子［9-10］。

國內研究報道NDRG1和NDRG2在喉鱗狀細胞癌細胞癌組織中低表達，研究結果顯示NDRG2 在45例喉鱗狀細胞癌中的陽性率為33.3%，在18例癌旁組織中的陽性率為83.3%，差異有統計學意義［11］。與國內外既往研究結果一致，本研究表明，喉鱗狀細胞癌組織中NDRG2 陽性表達率（24.39%）明顯低于癌旁組織（85.37%）。與既往研究不同的是，本研究所用癌旁組織均為配對癌旁組織，減少了免疫組化染色中因病人組織來源差異帶來的誤差。研究結果顯示：TNM III&IV 期喉鱗狀細胞癌的NDRG2陽性率顯著低于TNM I&II 期病人，說明NDRG2 可能參與喉鱗狀細胞癌的發生、發展。對伴有淋巴結轉移喉鱗狀細胞癌病人中NDRG2 陽性率低于未發生轉移病人，其他臨床病理特征分組間NDRG2陽性率差異無統計意義，提示NDRG2可能參與抑制喉鱗狀細胞癌淋巴轉移。

在喉鱗狀細胞癌的細胞學基礎研究方面，本研究應用慢病毒過表達Hep-2細胞中NDRG2的表達，研究結果顯示Hep-2 細胞NDRG2 基因及蛋白水平明顯增高。細胞生物學特性的檢測中，Transwell 遷移及侵襲實驗結果顯示：與普通Hep-2細胞相比，過表達NDRG2 的Hep-2 細胞侵襲及轉移能力明顯降低，證實了NDRG2 可能參與了喉癌的進展和轉移，在臨床上，NDRG2的表達水平的變化影響著喉鱗狀細胞癌TNM分期及淋巴結轉移，進而影響疾病的治療效果與預后，與既往國內外此方面的研究結果及結論一致［11］。本研究通過喉鱗狀細胞癌組織學水平及Hep-2 細胞學水平的研究相結合，實驗結果達到了預期一致的結果，更有力的證實了NDRG2作為抑癌分子參與喉鱗狀細胞癌發生及進展的過程。

在NDRG2與喉鱗狀細胞癌發生、發展的機制研究中，NDRG2可調控腫多種瘤侵襲及轉移相關蛋白及細胞信號轉導通路，其中部分蛋白與通路已被證實對喉鱗狀細胞癌侵襲及轉移的發揮明確的調控因素。例如，上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）是鈣粘附蛋白（cadherin）家族成員，可發揮一致腫瘤細胞侵襲及轉移的作用，是已經取得共識的腫瘤抑制分子。相關的細胞及組織學實驗顯示，與早期喉鱗狀細胞癌病人相比，E-cadherin 在中晚期喉鱗狀細胞癌中表達下調，并與不良預后及生存期密切相關［12］。而多項研究已證實 NDRG2 與 E-cadherin 表達呈正相關。其可能的機制為NDRG2 可增強糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而導致Snail 溶酶體降解，進而導致 E-cadherin 轉錄抑制［13-14］。因此，在喉鱗狀細胞癌中，NDRG2 也可通過此種機制上調E-cadherin的表達，從而抑制腫瘤侵襲及轉移。NDRG2 與基質金屬蛋白酶家族（MMP）的相關性也在近年來的研究中逐漸得到證實。MMP 家族蛋白是另一類與腫瘤侵襲及轉移關系密切的促癌因素。MMP2和MMP9已被證實在喉鱗狀細胞癌中表達上調，并在腫瘤的形成、進展及預后中扮演重要角色［15，16］，而 NDRG2 在多種腫瘤中可通過調控MMP2和 MMP9 的表達而抑制腫瘤侵襲及轉移［10，17］。因此，通過抑制MMP2 和MMP9 的表達而發揮抑癌分子的作用，也可能是NDRG2抑制喉鱗狀細胞癌侵襲及轉移的分子機制之一。但是，NDRG2在喉鱗狀細胞癌抑制侵襲及轉移的具體機制，仍需進一步的實驗來逐步闡明。

綜上所述，本研究通過免疫組化從組織學方面證實發現NDRG2在喉鱗狀細胞癌中表達下調，通過包裝NDRG2 慢病毒提高喉鱗狀細胞癌NDRG2 的mRNA 及蛋白表達水平，進而行細胞侵襲實驗和遷移實驗證實NDRG2 可抑制喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞侵襲及轉移，通過體內及體外實驗相結合說明NDRG2可能在喉鱗狀細胞癌的發生、發展中可能發揮重要的作用。在喉鱗狀細胞癌的臨床綜合治療中，以本NDRG2作為喉鱗狀細胞癌靶向治療的潛在的分子靶點，可能會發揮重要的治療作用，具有較高的臨床轉化應用價值。

（本文圖1，4，5見插圖10-1）