微小RNA-558 靶向調控叉頭框轉錄因子C1 促進卵巢癌SKOV3 細胞的增殖和侵襲力

李靜，王金銘，任琛琛，楊立，劉泇希，白楊

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，在卵巢腫瘤中它的發病率占50%～70%［1］。在早期，卵巢癌多無明顯表現，具有較高的病死率［1-2］。目前研究的主要理論認為：細胞的過度增殖和侵襲力的異常參與了腫瘤的發生發展［2］，微小RNA（microRNA，miRNA）和卵巢癌的發生發展存在密切關系，通過對下游靶基因的調控表達，miRNA 影響了細胞的增殖和侵襲能力，可能導致卵巢癌的發生發展［3］。其中，miR-558 是目前被發現參與腫瘤發生發展過程的一種非常重要的新的癌基因，但是miR-558在卵巢癌組織中的表達以及miR-558 在卵巢癌發生發展過程中的作用機制尚不明確，并且miR-558和叉頭框轉錄因子C1（FOXC1）之間的調控關系尚未見報道［4］。本研究主要探討miR-558 在卵巢癌組織中的表達情況、miR-558 與FOXC1 基因之間的調控關系和miR-558 對人卵巢癌腺癌細胞SKOV3 細胞增殖、侵襲能力的影響，在卵巢癌的發生機制及治療思路方面提供一些新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年1月至2017年12月鄭州大學第三附屬醫院婦產科同期收治的25 例上皮性卵巢癌、25例交界性卵巢上皮性腫瘤和25例良性卵巢上皮性腫瘤病人，經過知情同意，取其手術切除的部分卵巢組織標本；上皮性卵巢癌組年齡范圍為35～76 歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期6 例、Ⅲ～Ⅳ期19 例，中高分化10例、低分化15例；交界性卵巢上皮性腫瘤組年齡范圍為39～65歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期12例、Ⅲ～Ⅳ期13例，中高分化13例、低分化12例；良性卵巢上皮性腫瘤組年齡范圍為31～55歲。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。病人對研究方案均簽署了知情同意書。由第四軍醫大學病原微生物學教研室惠贈卵巢腺癌細胞系SKOV3細胞。

1.2 方法

1.2.1主要試劑 從廣州銳博科技有限公司購買miR-558 的模擬物、抑制物及陰性對照。miR-558、小核RNA6（U6）的特異性引物、FOXC1 的引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-肌動蛋白（β-actin）抗體、FOXC1 抗體購買于美國Abcam 生物技術有限公司。實時熒光定量PCR 試劑盒購買于北京鼎國公司產品。

1.2.2驗證 miR-558對FOXC1基因的調控作用借助于權威的生物信息學靶基因預測網站（PicTar、mi-Randa 和 TargetScan），將 miR-558 的名稱和物種輸入，預測與miR-558相關的靶基因FOXC1；通過熒光素酶報告基因實驗，驗證miR-558對FOXC1基因的靶向調控作用，構建熒光素酶報告基因載體質粒［（含有FOXC1 基因3’-非翻譯區（UTR）中潛在結合位點）］，野生型FOXC1基因3’-UTR（野生型-FOXC1-2-3’-UTR）和突變型FOXC1 基因3’-UTR（突變型-FOXC1-3’-UTR），放入-20 ℃冰箱保存備用。把質粒和miR-558共同轉染到SKOV3細胞系中，培養48 h，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定并計算海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的比值，以此值表示細胞熒光素酶的水平。

1.2.3細胞培養及轉染 在RPMI1640 培養基中（含1%青霉素及鏈霉素及10%胎牛血清）加入SKOV3 細胞，恒溫培養箱的溫度為37 ℃，含5%二氧化碳，后續實驗選取對數生長期的SKOV3 細胞；選取并計數對數生長期的SKOV3 細胞，按照2.0×105個/孔接種到6 孔培養板中進行培養。轉染在細胞生長態勢較好的時候進行。將轉染實驗細胞分成三組，分別為miR-558 模擬物組、miR-558 抑制物組及陰性對照組。將miRNA 轉染到SKOV3 細胞中，miRNA 由羧基熒光素（Carboxyfluorescein，FAM）標記。轉染之前，充分混合miRNA 和轉染試劑，在室溫下放置5 min，然后放置到培養箱的細胞培養板內，開始轉染反應；轉染24 h 以后，在200 倍光鏡及熒光顯微鏡下分別觀察并計數，把表達熒光蛋白的細胞作為陽性細胞，計算其轉染效率，轉染效率為陽性細胞數與總細胞數的比值。

1.2.4實時熒光定量PCR 技術檢測 卵巢組織SKOV3 細胞中 miR-558 的表達水平以及 SKOV3 細胞中FOXC1 的mRNA 的表達水平將細胞的總RNA用Trizol一步法提取，濃縮，計算總RNA的純度和質量。采用實時熒光定量PCR技術進行試驗后，行融解曲線分析，每個實驗均重復3 次。對結果采用2-△△ct法分析（ct值為反應的實時熒光強度明顯大于背景值時的循環數）。

1.2.5蛋白印跡法檢測 SKOV3 細胞中FOXC1 蛋白的表達水平提取總蛋白后測定濃度，依標準進行凝膠電泳，封閉液進行封閉，加入兔抗人FOXC1 一抗（1∶5 000 稀釋），在室溫下孵育2 h，然后洗滌3次，加入二抗，室溫下再孵育1 h，洗滌3次，把β-actin 作為內參，分析其灰度值，計算FOXC1 蛋白的相對表達水平（FOXC1 蛋白與β-actin 的灰度值的比值）。該實驗重復進行3次。

1.2.6CCK-8 法檢測 轉染后SKOV3 細胞的增殖情況將對數生長期的SKOV3 細胞接種于96 孔板中，在轉染后24、48、72、96 h，采用CCK-8 試劑盒來檢測細胞處于450 nm的吸光度（A）值并且記錄。計算細胞增殖率［（實驗組A值-空白對照組A值）/（對照組組A 值-空白對照組A 值）×100%］。本實驗重復進行3次。

1.2.7基質膠侵襲實驗檢測 轉染后SKOV3 細胞的侵襲力將轉染后24 h的SKOV3細胞進行收集，細胞懸液加入到穿膜小室內，培養36 h，取出小室，擦拭掉上室細胞，把那些已經侵入并且貼附于下層微孔膜的細胞用多聚甲醛固定5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后在顯微鏡下觀察，隨機在每張微孔膜中選5個視野進行細胞計數。此實驗重復進行3次。

1.3 統計學方法使用SPSS 21.0 軟件包對實驗數據進行統計分析。計量資料用±s 來表示，所有數據均進行正態檢驗并且符合正態分布，采用單因素方差分析進行多組間的比較，采用獨立樣本t檢驗對兩組間進行比較。P＜0.05 時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 驗證miR-558對FOXC1基因的靶向調節作用上述3個權威的生物信息學靶基因預測數據庫預測得出miR-558的靶基因是FOXC1，熒光素酶報告基因實驗顯示，含有miR-558的質粒以及含有FOXC1基因的重組質粒共同轉染SKOV3細胞后，模擬物組熒光素酶相對活性為（0.56±0.01），陰性對照組熒光素酶相對活性為（1.12±0.02），與陰性對照組相比較，模擬物組的熒光素酶活性下降了49.50%（P＜0.05）。

2.2 卵巢組織中的miR-558 的相對表達水平比較實時熒光定量-PCR技術結果顯示，上皮性卵巢癌、交界性卵巢上皮性腫瘤和良性卵巢上皮性腫瘤病人卵巢組織中miR-558 的相對表達水平分別為（3.43±0.42）、（2.47±0.35）、（1.37±0.31)，各組之間兩兩比較，均差異有統計學意義（均P＜0.05）。

實時熒光定量-PCR技術的結果顯示，在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對照組中，SKOV3 細胞miR-558 的表達水平分別為（2.37±0.17）、（0.64±0.17）、（1.14±0.11），miR-558各組間兩兩比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）；在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對照組中，SKOV3細胞的FOXC1基因轉錄出的mRNA的表達水平分別為（0.51±0.10）、（2.27±0.12）、（0.99±0.11），FOXC1的mRNA表達水平各組間兩兩比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

蛋白印跡法結果顯示，在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對照組SKOV3細胞中，FOXC1蛋白的表達水平分別為（0.83±0.07）、（2.17±0.15）、（1.47±0.21），FOXC1 蛋白的表達水平各組間兩兩比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

CCK-8 結果顯示，miR-558 模擬物組的細胞增殖率顯著高于陰性對照組，抑制物組細胞的細胞增殖率明顯低于陰性對照組，模擬物組中增殖率水平高于抑制物組，各組間兩兩比較，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 卵巢癌組織CCK-8實驗結果

基質膠侵襲實驗結果顯示，在miR-558 模擬物組、抑制物組和陰性對照組SKOV3 細胞中，SKOV3細胞穿透基底膜的細胞數分別為（158.33±9.45）、（67.01±10.58）、（117.67±16.86）（P＜0.05）。miR-558細胞侵襲力水平各組間兩兩比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌的發病率位居女性生殖系統惡性腫瘤的前3 位，而它的死亡率卻位居婦科惡性腫瘤之首［1］。據不完全統計，2015年，我國大約有5萬多名女性被確診為卵巢癌，約3 萬例病人死于卵巢癌［1-2］。腫瘤細胞異常的增殖和侵襲能力是惡性腫瘤的主要生物學特征，細胞的增殖和侵襲能力是影響癌癥治療和預后的重要因素。腫瘤細胞異常的增殖力與侵襲力相互作用，共同促進癌細胞的生長，最終導致癌癥的發展轉移和化療耐藥［1，5-7］。因此，明確卵巢癌細胞增殖和侵襲能力過度的具體原因對控制卵巢癌的發生發展具有重大意義。腺癌是卵巢上皮性癌中的主要病理類型，本研究所選用的SKOV3 細胞系是卵巢腺癌細胞系能夠更為真實地反映卵巢癌的生物學特性。

miRNA 是小分子單鏈 RNA，由 21 至 23 個核苷酸組成，位于內源非編碼區，通過與靶mRNA 特異性的堿基配對，將靶mRNA 降解，或者抑制它的翻譯，繼而實現對目的基因的調控［3］。miR-558 是miRNA 中的一種，位于人類2 號染色體p22.3，能夠調節環氧合酶2和白細胞介素-1β的表達，誘導人關節軟骨細胞分解代謝［4］。有研究表明，miR-558可通過調控細胞的凋亡、增殖以及細胞的遷移、侵襲等生物學行為從而參與腫瘤的進展，如胃癌、成神經細胞瘤［8，10］。Li Y等［9］通過研究發現，在膀胱癌病人體 內 ，環 狀 RNAHIPK3（circHIPK3）是 低 表 達的，circHIPK3 能夠抑制miR-558 的表達水平，降低乙酰肝素酶的表達，從而調控細胞的遷移和侵襲及膀胱癌的血管生成，由此提示我們，miR-558能夠促進膀胱癌的腫瘤發生。華中科技大學同濟醫學院的 Qu H 教授團隊［10］通過研究發現 miR-558 能夠與缺氧誘導因子2的5’-非編碼區結合，促進缺氧誘導因子2 的表達從而促進成神經細胞瘤細胞的生長、遷移、侵襲和血管生成，從而促進腫瘤的發生，研究表明，高表達miR-558 的病人生存預后較差。同時Qu H教授團隊［11］也在成神經細胞瘤的細胞中，通過敲除內源性miR-558 的表達，證實其能夠通過活化乙酰肝素酶促進成神經細胞瘤的腫瘤生成和侵襲。華中科技大學同濟醫學院的Zheng L 教授團隊［8］發現在胃癌的體內實驗和體外實驗中，miR-558 能夠識別乙酰肝素酶啟動子中的互補位點，以AGO蛋白家族成員1（Argonaute 1）依賴的方式結合SMAD 家族成員4（Smad4）降低Smad4的表達，從而促進胃癌的進展。這些研究與我們的結果相一致，從而更加明確了miR-558的致癌作用。

FOXC1 基因長約1787kb，位于人類6 號染色體p25.3，經轉錄翻譯形成FOXC1 蛋白。最新的研究表明，FOXC1通過激活趨化因子受體4（CXCR4），能夠參與癌癥的發生發展，并且能夠與活化T-細胞核因子1（NFATC1）構成基因遺傳軸參與疾病的發展［12］。本課題組的前期研究已經通過QRT-PCR 技術和免疫組化法分析上皮性卵巢癌、交界性卵巢上皮性腫瘤和良性卵巢上皮性腫瘤病人的卵巢組織，明確在上皮性卵巢癌中FOXC1 的表達水平是降低的，與本次研究中的miR-558 的表達水平呈負向相關性［13-14］。同時本研究我們通過分析miRNA 靶基因預測（PicTar、miRanda 和TargetScan）數據庫和熒光素酶報告實驗明確了miR-558 對FOXC1 的靶向調控作用。本課題組通過前期研究發現在重組FOXC1慢病毒表達穩定的SKOV3的細胞中，細胞的增殖和侵襲能力受到明顯抑制，在本次研究中我們進一步通過細胞實驗明確了FOXC1 對卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力的抑制作用是由miR-558 對FOXC1的靶向調控實現的［15］。

綜上所述，miR-558 通過靶向調控FOXC1 的表達，能夠促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，這為卵巢癌的發病機制提供了重要的理論依據。但是miR-558在卵巢癌病人血清中的具體表達情況以及在卵巢癌裸鼠移植瘤動物模型中的具體作用尚不明確，且與卵巢癌病人生存預后之間的關系尚不清楚，這仍然是本課題組下一步要深入研究的重點。