吉西他濱與厄洛替尼聯(lián)合治療胰腺癌的試驗研究

張強，秦愛玉，秦玉剛

胰腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤的一種，具有早期難發(fā)現(xiàn)，發(fā)病預(yù)后差，治療難度大等特點［1］。近年來胰腺癌呈現(xiàn)出病發(fā)群體年輕化、發(fā)病死亡率上升的趨勢，故尋找更好的治療方案引起廣泛的關(guān)注［2］。盡管通過手術(shù)切除可以根治胰腺癌，但由于病人確診時多為晚期使得術(shù)后存活率大大降低。吉西他濱是一種細(xì)胞周期特異性的DNA合成和修復(fù)抑制劑，是延長晚期胰腺癌病人生存時間的最佳化療藥物［3-4］。胰腺癌細(xì)胞具有獲得性或內(nèi)在的耐藥性特點，使得吉西他濱單獨使用存在治療失敗后沒有后續(xù)治療方案的缺點，治療效果并不理想。因此需要新型的其他治療藥物與它聯(lián)合使用，在一定程度上達(dá)到增強抑癌作用，減少某些不良反應(yīng)的效果［5-6］。厄洛替尼是一種可以抑制表皮生長因子受體信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子抑制藥，具有一定的抗腫瘤作用［7］。本研究于2018年4月至2019年4月探討吉西他濱與厄洛替尼聯(lián)合使用對體外胰腺癌細(xì)胞的藥物聯(lián)合作用，為胰腺癌的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑吉西他濱（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號160605）、厄洛替尼（上海羅氏制藥有限公司，批號SH0039）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號 2016-0596）；RPMI-1640（RPMI 是 Roswell Park Memorial Institute 的縮寫，代指洛斯維·帕克紀(jì)念研究所。RPMI 是該研究所研發(fā)的一類細(xì)胞培養(yǎng)基，1640 是培養(yǎng)基代號。）培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國，批號AAXR0596）；八肽膽囊收縮素-8（Cholecystokinin octapeptide-8，CCK-8）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號2018-11A1058）；胰蛋白酶（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號2018-06A0012）；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司，批號NJ180023）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。在溫度為37℃、二氧化碳含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含有10%的胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞系。細(xì)胞單層貼壁生長，待細(xì)胞貼壁生長完全后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本研究所用胰腺癌細(xì)胞PANC-1（人胰腺癌細(xì)胞PANC-1）均為對數(shù)生長期細(xì)胞（目前無資料認(rèn)為胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 在RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)是會影響PANC-1的活性）。

1.3 PANC-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察用0.25%胰蛋白酶將處于對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，用6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔以1.0×103量接種細(xì)胞并補充培養(yǎng)液至每孔2 mL，每兩天更換一次培養(yǎng)液。加入厄洛替尼 1.5 mg 分別作用24、48、72 h 后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，與對照組做比較（每個時間點設(shè)置12個培養(yǎng)皿）。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測用CCK-8法分別檢測吉西他濱與厄洛替尼對Panc-1 細(xì)胞增殖的影響。用胰蛋白酶處理對數(shù)生長期的PANC-1 細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，通過細(xì)胞計數(shù)將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為5×104/mL，以1×104/孔的細(xì)胞數(shù)量接種細(xì)胞到96孔板。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，將原培養(yǎng)液換為含有不同濃度梯度吉西他濱（0，5，10，20，40，80，160 nM）和厄洛替尼（0，2，4，8，16，32，64，128 nM）的培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)6 個重復(fù)孔，其中，藥物濃度為0是對照組，另外給培養(yǎng)板留1 個孔只加入培養(yǎng)液作為調(diào)零孔。加藥后將培養(yǎng)板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng) 24、48、72 h（注：每個時間點設(shè)置12 個培養(yǎng)皿。）。藥物作用結(jié)束前1 h，向各孔加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測每個孔的吸光度（A）值，計算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率＝［1-（A實驗組-A空白調(diào)零）/（A對照組-A空白調(diào)零）］×100%，繪制生長曲線。并計算出兩種藥物分別對PANC-1細(xì)胞的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）。

1.5 Chou-Talalay 法進(jìn)行藥物聯(lián)合分析我們根據(jù)兩種藥物對PANC-1的IC50值，按照不同比例（厄洛替尼：吉西他濱＝1：2、1：1、2：1、3：1）和不同處理時間（24、48、72 h）重復(fù)觀察兩種藥物聯(lián)合使用對PANC-1 細(xì)胞的細(xì)胞毒性情況，以Chou-Talalay 法分析兩種藥物的聯(lián)合作用效果。我們收集所有實驗的結(jié)果，并獲得每個數(shù)據(jù)點的平均值，用組合指數(shù)CI 來反映兩種藥物之間的作用：CI＜1 表示協(xié)同作用，CI＞1分別表示拮抗作用。

1.6 細(xì)胞平板克隆實驗實驗分組：厄洛替尼組、吉西他濱組、聯(lián)合作用組（1：2、1：1、2：1、3：1），每組設(shè)12 個培養(yǎng)皿。用0.25%胰蛋白酶將處于對數(shù)生長期的PANC-1 細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，用6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔以1.0×103量接種細(xì)胞并補充培養(yǎng)液至每孔2 mL，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。將細(xì)胞分散均勻后，放入37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 周。每天固定時間拿出6 孔板在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS 沖洗3 次左右，加入4%多聚甲醛固定15 min。用結(jié)晶紫染色液對細(xì)胞染色后，漂洗，空氣干燥。在倒置顯微鏡低倍鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)，并計數(shù)各孔細(xì)胞克隆形成數(shù)，最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩剑寺?shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理。計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，不同時間點比較行重復(fù)測量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內(nèi)兩兩比較采用差值t檢驗。計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2分析，多組之間兩兩比較采用P值修正的方法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PANC-1 細(xì)胞形態(tài)用厄洛替尼處理后，正常細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞收縮，細(xì)胞間距離變大，細(xì)胞培養(yǎng)液中出現(xiàn)細(xì)胞碎片。隨著厄洛替尼作用時間的延長，細(xì)胞變化更加明顯（見圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察厄洛替尼處理后胰腺癌PANC-1細(xì)胞變化：A為24 h，B為48 h，C為72 h

2.2 細(xì)胞毒性試驗結(jié)果CCK-8試驗結(jié)果顯示：在給予系列濃度的厄洛替尼和吉西他濱培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺癌PANC-1細(xì)胞后，在一定時間內(nèi)，不同濃度的吉西他濱和厄洛替尼均能抑制PANC-1 細(xì)胞增殖，并且抑制作用隨濃度增加而增強，且一定濃度下，藥物處理時間越長，抑制作用越強［128 nM 厄洛替尼濃度72 h 細(xì)胞抑制率為（76.72±5.51）%；320 nM吉西他濱濃度72 h 細(xì)胞抑制率為（75.43±0.97）%］。各濃度組與對照組相比，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明，吉西他濱和厄洛替尼對胰腺癌PANC-1 細(xì)胞生長的影響具有時間-濃度依賴性。通過IC50 計算軟件計算藥物處理48 h 時的IC50值，結(jié)果顯示厄洛替尼對PANC-1 的IC50 值為12 nM，吉西他濱對 PANC-1 的 IC50 值為 80 nM。（見表1，2）。

表1 厄洛替尼對12例PANC-1細(xì)胞的抑制率比較/（%，±s）

表1 厄洛替尼對12例PANC-1細(xì)胞的抑制率比較/（%，±s）

注：球型性校P＞0.05，分析選取主體內(nèi)效應(yīng)檢驗，無需校正。顯著性標(biāo)記a、b、c、d、e 分別為和A、B、C、D、E 組同時點相比P＜0.05。時間精細(xì)比較顯著性標(biāo)記X，Y為和組內(nèi)第1、2時間點比較，P＜0.05。結(jié)果說明：同一時間點24 h，不同濃度其細(xì)胞抑制率均不同。同一濃度不同時間點，濃度2、4、8、32三個時間點均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。濃度16，濃度64和濃度128三個濃度組，48 h和72 h比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余均差異有統(tǒng)計學(xué)意義

厄洛替尼濃度2 nM 4 nM 8 nM 16 nM 32 nM 64 nM 128 nM球形檢驗χ2/P值組間差異（藥物濃度）F/P值主體內(nèi)效應(yīng)（時間點）F/P值交互效應(yīng)F/P值細(xì)胞抑制率24 h 13.28±7.04 25.75±3.58a 35.34±2.85ab 46.61±2.61abc 55.53±1.47abcd 69.45±4.98abcde 77.38±4.26abcdef 0.14，0.931 1 173.64，0.000 386.48，0.000 6.85，0.000 48 h 46.19±21.95x 26.64±3.78x 30.72±1.05abx 40.71±5.38abcx 61.11±4.89abcdtx 69.41±1.65abcdex 78.89±4.86abcdefx 72 h 89.23±3.53x，y 56.68±23.02xy 32.65±2.68abxy 37.03±5.84abcx 56.19±2.78abcdxy 63.57±2.10abcdx 76.72±5.51abcdefx

2.3 藥物聯(lián)合試驗結(jié)果根據(jù)厄洛替尼與吉西他濱對PANC-1 的IC50 值，分別按照不同比例重復(fù)觀察兩種藥物聯(lián)合使用對細(xì)胞的細(xì)胞毒性情況。

不同組合藥物對PANC-1 細(xì)胞的抑制率：整體比較（兩因素重復(fù)測量方差分析）知：組間差異、時間差異及交互作用均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩精細(xì)比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：厄洛替尼和吉西他濱聯(lián)合使用可以增大細(xì)胞抑制率，減少單獨使用吉西他濱的起效時間［厄洛替尼∶吉西他濱為3∶1是時，72 h 細(xì)胞抑制率為（89.89±1.56）%，IC50 值為（3.89±1.65）nmol/L］。詳見表3，4。

表2 吉西他濱對12例PANC-1細(xì)胞的抑制率比較/（%，±s）

表2 吉西他濱對12例PANC-1細(xì)胞的抑制率比較/（%，±s）

注：球型性校P＞0.05，分析選取主體內(nèi)效應(yīng)檢驗，無需校正。顯著性標(biāo)記a、b、c、d、e 分別為和A、B、C、D、E 組同時點相比P＜0.05。時間精細(xì)比較顯著性標(biāo)記X，Y 為和組內(nèi)第1、2時間點比較，P＜0.05。結(jié)果說明：同一時間點24 h，濃度5和濃度10濃度10和濃度20，濃度20和濃度40，濃度40和濃度80，結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同一濃度不同時間點，濃度5、10，24 h和48 h比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余濃度組三個時間點比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義

吉西他濱濃度5 nM 10 nM 20 nM 40 nM 80 nM 160 nM 320 nM球形檢驗χ2,P值組間差異（藥物濃度）F,P值主體內(nèi)效應(yīng)（時間點）F,P值交互效應(yīng)F,P值細(xì)胞抑制率24 h 9.33±4.15 14.39±9.21 20.39±6.14a 25.96±6.11ab 32.43±2.85abc 47.08±7.52abcde 58.92±2.11abcdef 1.45，0.458 530.13，0.000 472.85，0.000 11.53，0.000 48 h 11.07±4.16 18.63±2.21a 26.5±8.22abx 35.39±3.52abcx 49.04±10.06abcx 55.69±2.35abcdex 68.25±4.95abcdefx 72 h 37.80±20.13XY 17.08±1.79aXY 27.73±5.36abxy 43.07±3.17abcxy 51.86±3.78abcdxy 64.46±3.23abcdexy 75.43±0.97abcdefxy

2.4 Chou-Talalay 法分析吉西他濱與厄諾替尼的聯(lián)合作用效果采用Chou-Talalay 法分析吉西他濱與厄諾替尼的聯(lián)合指數(shù)CI，在不同的聯(lián)合給藥方案中，2∶1 組和3∶1 組處理 24、48、72 h 均表現(xiàn)出協(xié)同作用，尤其是48 h，從細(xì)胞生長抑制率CI 圖中可以看出，隨著細(xì)胞生長抑制率的增加，CI 值逐漸下降。當(dāng)細(xì)胞生長抑制率達(dá)到35%時，聯(lián)合效應(yīng)開始出現(xiàn)協(xié)同作用（小于0.9）。當(dāng)細(xì)胞生長抑制率為40%時，CI 下降（均小于0.5），具有的協(xié)同作用。同時，2∶1組曲線低于3∶1組曲線，說明厄洛替尼和吉西他濱濃度比為2∶1 的協(xié)同效應(yīng)優(yōu)于濃度比3∶1（圖2，表5）。

表3 不同組合藥物對12例PANC-1細(xì)胞的抑制率比較/（%，±s）

表3 不同組合藥物對12例PANC-1細(xì)胞的抑制率比較/（%，±s）

注：整體分析為兩因素重復(fù)測量方差分析，資料球型性校正采用HF 系數(shù)法。組間精細(xì)比較為LSD-t 檢驗，顯著性標(biāo)記a、b、c、d、e分別為和A、B、C、D、E 組同時點相比P＜0.05。時間精細(xì)比較為差值t檢驗，與組內(nèi)第1時間點比較fP＜0.05

藥物組合（厄洛替尼：吉西他濱）A→1∶0 B→0∶1 C→1∶2 D→1∶1 E→2∶1 F→3∶1整體分析組間F，P值時間F，P值交互F，P值細(xì)胞抑制率24 h 43.89±3.00 64.42±4.99a 50.60±6.05ab 67.34±4.20ac 63.87±2.94acd 81.97±4.21abcde（HF系數(shù)：0.829 5）344.191，0.000 79.761，0.000 16.391，0.000 48 h 33.17±4.28t 78.20±4.29at 49.52±8.40ab 85.54±8.43abct 63.45±3.96abcd 91.61±3.96abcdet 72 h 53.29±5.08t 80.13±5.34at 59.52±8.34abt 82.22±3.14act 70.54±3.77abcdt 89.89±1.56abcdet

圖2 不同組合藥物處理24 h時的細(xì)胞抑制率CI圖

2.5 細(xì)胞平板克隆形成實驗結(jié)果每組接入1 000個細(xì)胞，3周后平板克隆形成實驗結(jié)果為：對照組細(xì)胞數(shù)為361；單獨加厄洛替尼組細(xì)胞數(shù)為128；單獨加吉西他濱組細(xì)胞數(shù)為114，聯(lián)合作用組細(xì)胞數(shù)為118、98、76、80。結(jié)果表明，加入藥物后細(xì)胞克隆形成率下降，且兩種藥物聯(lián)合干預(yù)PANC-1 細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞克隆形成數(shù)低于單獨使用吉西他濱或厄洛替尼干預(yù)，其細(xì)胞克隆形成率也下降（P＜0.05），見表6。

表4 不同組合藥物處理下PANC-1細(xì)胞的IC50值/（nmol/L，±s）

表4 不同組合藥物處理下PANC-1細(xì)胞的IC50值/（nmol/L，±s）

藥物作用時間24 h 48 h 72 h整體分析組間 F，P 值時間 F，P 值交互 F，P 值單獨給藥厄洛替尼25.71±1.27 12.36±2.05 6.63±1.41（HF系數(shù)：0.683 9）290.526，0.000 136.472，0.000 19.201，0.000吉西他濱206.28±2.01 80.59±1.02 35.31±0.93（HF系數(shù)：0.715 2）292.153，0.000 115.866，0.000 7.129，0.000聯(lián)合給藥（厄洛替尼∶吉西他濱）1∶2 27.36±2.16 12.03±1.72 6.52±3.11 1∶1 26.58±2.63 10.47±2.18 5.84±1.68 2∶1 20.53±3.18 7.54±2.39 4.41±2.06 3∶1 18.28±2.14 5.51±1.93 3.89±1.65

表5 不同組合藥物處理48 h時的CI值

表6 不同組合藥物處理下PANC細(xì)胞克隆形成情況

3 討論

近年來，隨著生活環(huán)境和生活方式的改變，胰腺癌發(fā)病率也逐漸上升，并伴隨著發(fā)群體年輕化、發(fā)病死亡率升高等特征［8-9］。胰腺癌細(xì)胞中表皮生長因子受體過度表達(dá)，這對腫瘤細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用，導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后性差［10］。其發(fā)病初期癥狀不明顯，使得多數(shù)病人錯失了最佳手術(shù)時間［11］。只能通過后期治療來提高生存的概率，延長生存時間［12］。治療晚期胰腺癌最有常用的方法是使用化療藥物［13］。吉西他濱單藥是目前晚期胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，具有一定的臨床收益率和客觀緩解率。胰腺癌已經(jīng)獲得了對吉西他濱的抵抗力，使得這種治療方法受到耐受性的限制，且治療失敗后存在缺失后續(xù)有效治療方案的缺點［14-15］。因此，研發(fā)新型藥物或者尋找合適藥物與吉西他濱協(xié)同作用對胰腺癌的治療極為重要。但是在大規(guī)模隨機臨床試驗中發(fā)現(xiàn)多種以吉他西濱為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案都未能顯示出比吉西他濱單藥有更好的生存獲益［16-17］。厄洛替尼是一種新型抗腫瘤藥物，它與三磷酸腺苷存在競爭關(guān)系，可以抑制在癌組織中表達(dá)率很高的人表皮生長因子受體絡(luò)氨酸激酶活性，抑制磷酸化反應(yīng)，從而阻滯下游信號傳導(dǎo)，達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖作用［18］。厄洛替尼在治療非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮作用，在其他腫瘤疾病治療中也能起到促進(jìn)作用［19-20］。本研究通過比較吉西他濱與厄洛替尼的單獨使用與聯(lián)合使用對體外胰腺癌細(xì)胞生長影響，來初步探討兩種藥物的聯(lián)合作用效果。

在PANC-1 細(xì)胞形態(tài)觀察實驗中，用厄洛替尼處理細(xì)胞，并觀察不同時間處理下細(xì)胞形態(tài)改變。正常的胰腺癌細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下貼壁生長活躍、細(xì)胞數(shù)量較多，且個體飽滿，輪廓清晰。而加藥處理后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞間隙變大，數(shù)量減少。隨著處理時間的延長，細(xì)胞的生長狀態(tài)與正常貼壁生長差別更明顯。這說明厄洛替尼起到了抑制細(xì)胞生長的作用，且抑制效果與作用時間相關(guān)。

在細(xì)胞毒性試驗中，用不同濃度的吉西他濱和厄洛替尼培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺癌PANC-1 細(xì)胞，細(xì)胞抑制率均較對照組高，表明吉西他濱和厄洛替尼都可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖?？刂铺幚頃r間不變，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞抑制率也增大?？刂扑幬餄舛炔蛔?，隨著藥物處理時間的延長，細(xì)胞抑制率也增大。這表明一定條件下，吉西他濱和厄洛替尼對癌細(xì)胞生長的影響具有時間-濃度依賴性。

在藥物聯(lián)合分析實驗中，厄洛替尼和吉西他濱聯(lián)合使用可以增大細(xì)胞抑制率，減少單獨使用吉西他濱的起效時間，降低IC50 值。采用Chou-Talalay法分析吉西他濱與厄諾替尼的聯(lián)合指數(shù)CI，在細(xì)胞抑制率達(dá)到一定數(shù)值后，聯(lián)合指數(shù)小于1，吉西他濱與厄諾替尼發(fā)揮協(xié)同作用。這為胰腺癌細(xì)胞對吉他西濱產(chǎn)生耐藥性提供了新的解決思路，可以通過厄洛替尼的協(xié)同作用來減少吉西他濱的使用量，使得吉西他濱作用失敗后還可以繼續(xù)采取其他補救措施。

在細(xì)胞平板克隆實驗中，接入相同數(shù)量細(xì)胞，藥物處理一段時間后，藥物聯(lián)合作用組比單獨加厄洛替尼或吉西他濱組的細(xì)胞克隆數(shù)量減少，細(xì)胞克隆形成率下降，這表明兩種藥物聯(lián)合對用對PANC-1 細(xì)胞的生長影響作用較大，聯(lián)合使用兩種藥物對體外胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制更有效。

綜上所述，吉西他濱和厄洛替尼單獨使用均能在體外抑制人胰腺癌細(xì)胞的生長，發(fā)揮抑制胰腺癌腫瘤的作用。吉西他濱和厄洛替尼聯(lián)合使用可以降低兩種藥物的使用劑量并起到藥物的協(xié)同作用，達(dá)到并提高抑制體外胰腺癌細(xì)胞增殖的效果。盡管厄洛替尼與吉西他濱聯(lián)合治療胰腺癌有一定功效，但其療效是否伴有嚴(yán)重不良反應(yīng)仍需被考慮。