內質網應激和未折疊蛋白反應相關分子對兒童自身免疫性腦炎T 淋巴細胞的影響

王丹，劉曉娟，康天

內質網（Endoplasmic Reticulum，ER）參與調控多種細胞功能，包括蛋白質折疊、翻譯后修飾（PTMs）、脂肪酸生物合成、解毒，細胞內鈣離子儲存等［1］。細胞內的分泌蛋白和跨膜蛋白主要在內質網中合成［2］。內質網通過折疊、二硫鍵的形成、N-糖基化和許多其他PTMs1對新合成的蛋白質進行加工和修飾，而且它還與葡萄糖、脂類和膽固醇代謝等過程有關［3-5］。在ER中，蛋白質在伴侶蛋白和蛋白二硫鍵異構酶的幫助下，精確地折疊成天然構象。然而，當細胞受到各種內外因素的刺激，如病毒感染、炎癥以及其他細胞水平的異常等，使ER蛋白質的折疊功能異常，導致ER內未折疊蛋白的積累，稱為內質網應激（Endoplasmic ReticulumStress，ERS）［6-8］。然而，細胞已經發展出一種機制來感知這些變化，并通過特異性信號轉導通路的激活來重建內質網穩態，稱為未折疊蛋白反應（Unfolded Protein Response，UPR）［9-10］。

UPR 信號通路可通過誘導折疊酶、伴侶蛋白、氧化還原酶的轉錄，減少蛋白質翻譯，通過ER相關蛋白降解途徑（ERAD）降解未折疊蛋白來恢復內質網穩態［11］。然而，當ERS 持續進行時，UPR 從存活轉化為死亡誘導通路，將受影響的細胞清除出系統，而無限制的凋亡會導致器官細胞的丟失［12-13］。促凋亡信號通路使活性氧和促凋亡蛋白增加，激活炎癥分子，導致許多疾病的發生［14］。ER 環境的紊亂還會導致許多蛋白的PTM異常，PTM可以通過生成新抗原激活自身免疫反應［15］。一些ER蛋白，如胰島素，葡萄糖調節蛋白78，谷氨酸脫羧酶65 等因PTM異常而轉化為新抗原［14，16］，這些新抗原激活自身反應性T細胞，產生病理狀態［17］。此外，在大鼠胰島素瘤細胞和非肥胖糖尿病小鼠中，細胞因子誘導ER應激產生翻譯后修飾的免疫球蛋白結合蛋白（BIP）［18-19］，BIP導致自身反應性T細胞產生并分泌較高水平的白細胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）［20］。此外，ER應激介導的UPR使重要的促炎細胞因子上調，使組織進一步損傷［21］，在自身免疫性疾病的發病機制中起重要作用［22-23］。有趣的是，細胞因子在反饋回路機制中可以通過UPR 誘導內質網應激和凋亡［24］。綜上所述，ERS對自身免疫性疾病的發展有一定的作用。

兒童自身免疫性腦炎是由自身免疫功能異常而引發的免疫性疾病，其形式是自身抗體和T細胞攻擊宿主的身體［25-26］。大多數自身免疫性疾病通常以自身抗體、促炎細胞因子和自身反應性T細胞的表達為特征［27-28］。許多環境因素，包括微生物感染、化學物質暴露、自由基和炎癥等，都是已知的觸發自身炎癥的因素［29-32］，所有這些因素均可誘導內質網應激，提示ERS可能與自身免疫性疾病的發病有關。淋巴細胞凋亡的失調使免疫功能發生障礙，如免疫缺陷和自身免疫。有研究表明，UPR信號通路中的轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白（C/EBP-）同源蛋白（CHOP）在細胞凋亡中起重要作用［33-34］。因此，本研究旨在探討ERS 對AE 病人T 淋巴細胞存活和凋亡的影響以及UPR信號通路在AE淋巴細胞存活和死亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料試劑：RPMI 1640 培養基；胎牛血清（美國Gibco-BRL 公司）；青霉素（美國Sigma 公司）；鏈霉素（美國Sigma 公司）；RIPA 細胞裂解液（上海碧云天生物公司）；蛋白酶抑制劑cocktail（美國Roche 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物公司）；ECL化學發光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Annexin-V-PE Kit（美國 BD 公司）；PI（美國BD 公司）；TG（美國Sigma 公司）；Cell Counting Kit-8（日本同仁化學研究所）；Ficoll-Paque Plus（通用電氣醫療集團）。抗體：BIP（CST，3177）；CHOP（CST，2895）；B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2），B 淋巴細胞瘤-XL（Bcl-XL），bcl-2 相關X 蛋白（Bax）（Santa Cruz）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（proteintech，10494-I-AP）；辣根過氧化物酶（HRP）標記鼠二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；HRP羊抗兔IgG（康為世紀，cw0103）。所有研究對象或其近親屬簽署知情同意書，本項研究所用方法符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，且經本院倫理委員會審核、批準后實施（倫理批號20170218），研究時間為2017 年2月至2019年2月。

1.2 方法

1.2.1外周血單核細胞分離和T淋巴細胞分選 在提供知情同意后，從石家莊市第一醫院兒科AE病人和年齡、性別匹配的健康供者處獲得30～40 mL的外周血樣本。外周血樣本用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH 7.4）1∶2 稀釋后置于淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque Plus）上，20 ℃離心30 min；從Ficoll-Paque與血清層間收集PBMCs，PBS洗滌2次。根據試劑盒說明書對T淋巴細胞進行分選。采用鏈霉親和素結合的CD11b/巨噬細胞抗原、人源化抗人（CD16）、B淋巴細胞抗原（CD19）、血小板反應蛋白受體（CD36）、巨核細胞糖蛋白IIb/IIIa（CD41a）、神經細胞黏附分子（CD56）和血紅糖蛋白A（CD235a）生物素化抗體復合物對外周血單核細胞進行負性分選，分離T細胞。即PBMCs 與加入蛋白酶抑制劑的抗體在室溫下孵育15 min，磁珠與單抗在室溫下孵育30 min。采用磁板純化T 細胞，純度大于99%，采用流式細胞儀計數T淋巴細胞。

1.2.2細胞培養 分選出的T淋巴細胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液，置于37 ℃、5%二氧化碳的細胞培養箱中培養。

1.2.3細胞生存能力分析 將AE 病人和健康供者的T 淋巴細胞接種于96孔板中，每孔接種1×104個T淋巴細胞，每個樣本接種6個復孔，用不同濃度的TG（0、0.5、1、5、10 nM）處理AE 病人和健康供者的T 細胞，48 h后分別在每孔加入CCK8溶液（每孔10μL），將96孔板置于細胞培養箱，37 ℃培養60 min。利用酶標儀在450 nm處通過吸光度值測量計數活細胞。

1.2.4Annexin V 和PI 染色進行凋亡分析 采用Annexin V/PI染色定量檢測細胞膜胞外側磷脂酰絲氨酸的含量。AE 病人和健康供者的T 淋巴細胞種于6 cm皿，待細胞密度約為70%時，TG（5 nM）處理48 h。收集細胞：用胰酶消化細胞，800 r/min 離心5 min，棄上清，由預冷的PBS 洗滌后，收集細胞。對照細胞（TG 未處理的AE 病人和健康供者的T 淋巴細胞）和TG 處理細胞在室溫下按照試劑說明書用Annexin V-FITC（5 μL）和 PI（10 μg/mL）染色 10 min，用流式細胞分析儀進行分析。

1.2.5細胞樣品蛋白質提取 將分選的AE 病人和健康供者的T淋巴細胞接種于6 cm皿，待細胞密度約為70%時，TG（5 nM）處理細胞，48 h后用PBS洗滌細胞并收集細胞。將加有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液加入收集的細胞，在冰上裂解15 min后，將細胞裂解液轉入1.5 mL離心管，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。離心后吸取上清液，并用蛋白質定量試劑盒進行定量。定量后每組樣品中加入1/4體積的5×Loading Buffer緩沖液，沸水煮沸5 min后-20 ℃保存。

1.2.6蛋白質印跡法（Western blot） 根據BCA 配膠試劑盒說明書，配制10%的平板凝膠。每組蛋白樣品取30 μg 進行凝膠電泳（恒壓120 V，2 h），甲醇激活PVDF 膜后轉膜（恒壓100 V，2 h），轉膜結束后在封閉緩沖液（5%脫脂牛奶）中室溫孵育60 min，TBST洗滌后一抗室溫孵育1 h后4 ℃過夜孵育。一抗孵育后取出PVDF膜，TBST洗3次，每次7 min，洗滌后二抗室溫孵育60 min，TBST洗3次，每次7 min，用ECL法檢測反應蛋白。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0進行本研究數據統計分析。觀測資料主要是計量數據，以±s表示，以單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey多重比較試驗對多組進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內質網應激對T淋巴細胞存活的影響用不同濃度的TG（0、0.5、1、5、10 nM）處理AE病人和健康供者外周血T淋巴細胞48 h，使用CCK-8試劑盒檢測AE病人和健康供者外周血T淋巴細胞的生存能力。實驗結果（圖1）顯示，不同濃度TG（0、0.5、1、5、10 nM）處理48 h后AE病人T細胞存活率分別為（9.92±0.42）%、（9.11±0.41）%、（7.06±0.39）%、（6.07±0.31）%、（5.02±0.30）%；健康供者T 細胞存活率分別為（10.46±0.47）%、（10.05 ± 0.49）% 、（9.91 ± 0.41）% 、（9.85 ±0.42）%、（9.77±0.41）%、兩組均呈劑量依賴性下降。與健康供體相比，AE病人T淋巴細胞在TG處理后T細胞存活率下降更為顯著，AE病人和健康供者外周血T淋巴細胞，差異有統計學意義。這些結果表明TG可明顯抑制AE病人T淋巴細胞的生存能力。

2.2 內質網應激對T 淋巴細胞凋亡的影響用ERS誘導劑TG（5 nM）分別處理AE病人和健康供者外周血T淋巴細胞，48 h后收集細胞，并進行AnnexinV和PI雙染，流式細胞術檢測淋巴細胞凋亡情況。檢測結果顯示（圖1），與健康供者相比，AE病人T細胞（15.65±1.11）%在體外比對照組（6.11±0.65）%更容易凋亡。此外，我們發現TG誘導AE病人和健康供者外周血T 淋巴細胞后，AE 病人的T 淋巴細胞（19.65±1.55）%凋亡水平明顯高于健康供者（10.89±1.03）% 和 未 進 行 TG 誘 導 的 AE 病 人（15.65±1.11）%，并且差異有統計學意義。這表明TG 刺激可促進AE病人的T淋巴細胞凋亡。

圖1 TG誘導可促進自身免疫性腦炎（AE）病人的T淋巴細胞凋亡

2.3 TG 誘導后T 淋巴細胞UPR 相關蛋白的表達將AE 病人外周血淋巴細胞（PBMCs）和健康供體中分離的T淋巴細胞，分別用TG（5 nM）處理這兩種細胞，48h 后收集細胞并提取蛋白。蛋白質印跡法檢測UPR 標志分子BIP（UPR 的中心調節因子）和CHOP（抑制Bcl-2基因啟動子）的蛋白表達水平，實驗結果（圖2）顯示：與健康供體UPR 標志分子BIP 和CHOP 的蛋白表達水平（0.50±0.05、0.53±0.06）%相比，AE病人外周血T淋巴細胞BIP（0.23±0.04）%的表達降低，而CHOP（0.81±0.07）%的表達顯著升高，差異有統計學意義（t=10.329、7.439，P＜0.01）。以上結果提示，BIP和CHOP可能介導內質網應激誘導的外周血T淋巴細胞凋亡。

圖2 毒胡蘿卜素（TG）誘導T淋巴細胞未折疊蛋白反應（UPR）相關蛋白表達

2.4 TG 誘導后T 淋巴細胞凋亡相關蛋白的表達內質網應激誘導的細胞凋亡受抗凋亡和促凋亡信號調控，包括Bcl-2、Bcl-XL、Bax。分別用TG（5nM）處理從AE 病人外周血淋巴細胞（PBMCs）和健康供體中分離T 淋巴細胞，48 h 后收集細胞并提取蛋白。蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bcl-XL 和Bax 的表達水平，實驗結果（圖3）顯示：與健康供體凋亡相關蛋白Bcl-2、Bcl-XL 和Bax 的表達水平［（1.41±0.04）%、（1.23±0.06）%、（0.51±0.01）%］相比，AE 病人的 T 細胞中抗凋亡蛋白 Bcl-2（0.73±0.07）%和Bcl-XL（0.51±0.05）%表達水平降低，而促凋亡蛋白Bax（1.25±0.05）%表達增加，差異有統計學意義（t=35.548、20.660、22.581，P＜0.01）。以上結果表明BIP和CHOP可能通過抗凋亡信號和促凋亡信號介導內質網應激誘導的外周血T淋巴細胞凋亡。

圖3 毒胡蘿卜素（TG）誘導T淋巴細胞凋亡相關蛋白表達

3 討論

AE的T細胞在其發病機制中具有重要的作用，而T淋巴細胞內環境平衡失調是AE最重要的發病機制之一。我們的研究證明內質網應激可明顯抑制AE病人T淋巴細胞的生存能力，促進AE病人T淋巴細胞凋亡。因此，調節內質網應激可能成為AE治療的一個有價值的藥理靶點。UPR在許多類型的免疫細胞中發揮著重要作用［35］。由于免疫細胞的分泌功能，其具有較多的內質網并且具有較高的蛋白質折疊活性，因此它們更容易受到毒素、疾病和病原體等誘發內質網應激因素的影響［36］。UPR在免疫功能中的作用可能是多種復雜免疫性疾病的發病機制之一［37］。我們的研究發現，AE病人外周血T淋巴細胞CHOP的表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達水平降低，而促凋亡蛋白Bax表達增加。這一結果證實UPR通路與AE的發生有關，同時可能通過調控抗凋亡信號和促凋亡信號介導內質網應激誘導的外周血T淋巴細胞凋亡。

BIP是ER應激反應的中心調控因子，各種應激因素可以誘導BIP的表達，它通過調控細胞凋亡和增殖來維持T細胞的存活［38］。內質網應激時T細胞存活的調控與CHOP蛋白的誘導表達有關，CHOP蛋白表達參與內質網應激誘導的細胞凋亡［33，39］。在本研究中，我們檢測了TG刺激后AE病人T細胞BIP和CHOP蛋白的表達水平，與健康供者相比，AE病人外周血T淋巴細胞BIP的表達水平降低，CHOP的表達水平顯著升高。此外，與健康供體相比，TG誘導后AE病人的T細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達水平降低，而促凋亡蛋白Bax表達增加。AE病人BIP反應可能導致ER應激時T細胞凋亡反應水平升高，導致T淋巴細胞減少。然而，BIP在T細胞活化、分化、增殖和存活中的確切作用尚不清楚。因此，確定細胞內BIP在T細胞病理生理和T細胞依賴性自身免疫性疾病（如AE）發展中的作用，可能有助于開發診斷標記物或治療靶點。