3.0T DCE-MRI定量參數聯合外周血micro RNA21t和金屬硫蛋白-1E對乳腺癌診斷價值

王琳琳，劉源源

乳腺癌是女性癌種中第1大癌癥且近年來發病率逐年上升，漸趨年輕化。主要治療方式為改良根治術、保乳術等，其中早期乳腺癌患者經治療后生存率高達90%[1-2]。腫瘤新生血管與腫瘤的發生、發展密切關聯，DCE-MRI可通過動態監測對比劑在腫瘤微循環中分布從而定量評估腫瘤血管情況如腫瘤新生血管密度、血管通透性等。腫瘤微環境中血管豐富以及通透性高、血流迅速，故而對比劑在微循環中代謝、分布相關常數偏高[3-4]。分子生物學快速發展，對乳腺癌研究逐步轉入基因、蛋白組學水平，蛋白分子、miRNAs與腫瘤增殖、遷移、侵襲密切關聯，micro RNA21通過調節抑癌基因、細胞分化及細胞凋亡(抑制程序性細胞死亡因子表達)等作用促進腫瘤生長[5]，金屬硫蛋白-1E可能通過上調Cyclin D1使得細胞進入S期，從而導致細胞增殖、凋亡失衡，引起細胞惡化[6]。腫瘤發生、發展中腫瘤血管新生以及腫瘤細胞惡性增殖是關鍵因素，其中DCE-MRI檢測可有效評估血流狀態，而血清金屬硫蛋白-1E、micro RNA21則可反映腫瘤惡性增殖、侵襲等生物學過程且已有研究發現DCE-MRI、血清因子聯合診斷良惡性腫瘤、轉移等具有良好效能[7]，故而推測聯合檢測可提高DCE-MRI診斷效能。本文探討3.0T DCE-MRI定量參數聯合外周血micro RNA21、金屬硫蛋白-1E對乳腺癌診斷價值。

材料與方法

1.一般資料

回顧性研究2017年2月-2019年10月收治156例乳腺病變患者(共164個病灶)，年齡28～52歲，平均年齡(38.58±4.98)歲。根據組織病理學檢測結果顯示良性腫瘤60例，惡性腫瘤96例。本次研究已獲得倫理委員會批準。

納入標準：①臨床觸診、乳腺鉬靶X線檢查或者超聲檢查初診為乳腺病變，并同意3.0T動態增強磁共振成像檢查；②既往未接受放療、化療、靶向治療；③圖像清晰，沒有明顯運動及呼吸偽影；④檢查1周內經組織病理學檢查確診。排除標準：①嚴重偽影，影響圖像質量，病理病灶與MRI檢查病灶不對應；②懷孕、哺乳期婦女；③檢查禁忌癥如對比劑過敏者。本次研究納入初始病例數162例，剔除影像資料不清晰、病歷資料不完整病例，最終納入156例。

2.檢查方法

影像學檢查:采用3.0T DCE-MRI磁共振掃描儀(德國西門子有限公司Magnrtome Skyra)進行檢查，選取8通道雙側乳房相控線圈。指導患者取俯臥位，保證雙側乳房自然懸垂于線圈內，掃描范圍為雙側乳腺組織和腋窩。掃描序列：橫軸面T2WI，設置掃描層厚3 mm，層間隔1.5 mm，TR/TE為4060 ms/70 ms，FOV 340 mm×340 mm以及采集矩陣358×448。橫軸面DWI：設置掃描層厚2.5 mm，層間隔0.5 mm，TR/TE為5700 ms/66 ms，b值分別為0、800 s/mm2。T1多翻轉角(T1-mapping)：TR/TE為5.64 ms/2.46 ms，翻轉角分別為5°、10°、12°、15°。T1動態增強序列：注射對比劑前掃描，約掃描40 s時則按體重采用高壓注射器于前臂靜脈團注磁共振對比劑(釓雙胺，美國GE公司)0.1 mmol/kg，流率2.5 mL/s，注射完成后追加15 mL生理鹽水，連續采集5期增強圖像，總掃描時相70次，其中第1時相17.3 s，之后時相4.58 s，總掃描時間5～6 min。

MRI數據處理：將動態增強圖像導入Omni-Kinetics軟件(GE公司V2.0.10軟件)并結合DWI、T2WI、灌注圖像確定病變范圍和具體位置。選取腫物實質成分強化最明顯處為感興趣區，即為病灶中央，選取3～5個ROI，面積≥2 mm2，盡量避開壞死、囊變以及出血區域，每個病變區測量3次取均值。以病灶感興趣區層面主動脈為輸入動脈擬合獲取動脈輸入函數，并借助Extended Tofts線性模型計算定量參數：速率常數(Kep)為組織間對比劑重新回到血管內速率常數；容量轉移常數(Ktrans)為對比劑從血管內擴散到血管外速率常數，血管外細胞外間隙容積比(Ve)則為Ktrans、Kep比值，是血管外細胞外間隙占整個體素容積比。

圖1 DCE-MRI影像學檢查。女，38歲，乳腺浸潤性導管癌Ⅲ級。a) 動態增強掃描見片狀強化，邊界模糊，形態不規則，左乳血管明顯強化、增粗; b) 左乳外上象限腺體中后1/3處呈現異常信號， T1WI呈稍低信號。ADC值0.840×10-3mm2/s。

血清金屬硫蛋白-1E表達水平測定 所有患者入組后清晨空腹抽取外周肘靜脈血5 mL，3000 rpm離心10 min，取上層血清保存于-80℃待測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清金屬硫蛋白-1E水平，取金屬硫蛋白-1E配制標準品溶液，在酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)上測得各溶液對應吸光度值(OD)，以OD值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線，將測得的OD值代入標準曲線計算得各樣品濃度，所有操作步驟均參照說明書進行，檢測試劑盒購自中國臺北亞諾法生技股份有限公司。

血清micro RNA21表達水平測定 采用TRIzol試劑盒(賽默飛世爾中國公司)提取血清總RNA，然后使用反轉錄試劑盒(賽默飛世爾中國公司)將總RNA進行反轉錄，得到模板單鏈cDNA，調整模板濃度至400 ng/μL，使用PCR試劑盒對cDNA進行PCR，反應條件為95℃ 預變性1 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸34 s，連續循環40次。以U6作為內參因子，根據micro RNA21與U6的Ct值計算相對表達量，以2-△△Ct表示相對表達量，其中△△Ct=(Ct結腸癌目的基因-Ct結腸癌U6)-(Ct對照目的基因-Ct對照U6)。

3.統計學分析

結 果

1.兩組患者基線資料比較

兩組患者入組前基線資料(表1)差異無統計學意義(P>0.05)。組織病理學結果顯示良性組患者60例，惡性組96例。156例患者共有164個病灶，其中良性組62個，惡性組102個。良性組病理類型包括纖維腺瘤41例，囊腫10例，漿細胞性乳腺炎9例。惡性組病理類型包括浸潤性導管癌67例，粘液腺癌7例，導管原位癌伴微浸潤22例。

表1 基線資料

2.兩組患者外周血micro RNA21和金屬硫蛋白-1E水平比較

惡性組患者micro RNA21、金屬硫蛋白-1E水平顯著高于良性組(P<0.05，表2)。

表2 外周血micro RNA21、金屬硫蛋白-1E水平比較

3.兩組患者3.0T DCE-MRI定量參數比較

惡性組患者Ktrans、Kep、Ve均顯著高于良性組患者(P<0.05，表3)。良性患者、惡性患者典型病例3.0T DCE-MRI圖(圖2、3)。

表3 兩組患者3.0T DCE-MRI定量參數比較

4.3.0T DCE-MRI定量參數與外周血micro RNA21和金屬硫蛋白-1E水平相關性

Ktrans、Kep、Ve分別與外周血micro RNA21、金屬硫蛋白-1E水平具有正相關性(P<0.05，表4)。

5.3.0T DCE-MRI以及外周血micro RNA21和金屬硫蛋白-1E診斷價值

表5 不同檢查方法診斷效能比較 [n(%)]

圖2 女，42 歲，左乳良性占位。a)橫軸面 DCE-MRI 圖，TIC 曲線，見左乳內上腫塊影；b) Ktrans; c) Kep; d) Ve 偽彩圖，紅色最亮處為病灶強化最明顯,Ktrans、Kep、Ve值分別為0.053/min、0.533/min、0.125。圖3 女，40 歲，右乳浸潤性導管癌。a) 橫軸位面DCE-MRI 圖，TIC 曲線,見右乳內上強化腫塊影，邊緣見毛刺影；b) Ktrans ;c) Kep;d) Ve 偽彩圖，紅色最亮處為病灶強化最明顯,Ktrans、Kep、Ve值分別為0.159/min、1.166/min、0.145。

因子micro RNA21金屬硫蛋白-1EKtrans(min-1)0.666,0.0000.597,0.000Kep (min-1)0.490,0.0000.497,0.000Ve0.463,0.0000.376,0.000

討 論

影像學方法在乳腺癌早期診斷以及預后評估中越來越重要，其中MRI診斷早期乳腺癌敏感度高達90%。但乳腺MR診斷一般基于動態增強定性、半定量分析，其中定性分析診斷惡性病變時呈現出有一定重疊II型曲線，而半定量分析在高時間分辨率下僅能完成腫瘤區局部灌注，或者完成雙乳掃描時間分辨率較低，故而對于乳腺癌良性、惡性診斷效能有待改善[8-9]。乳腺癌是血管依賴性腫瘤即其的發生、發展以及轉歸與血管新生關系密切，腫瘤新生血管具有數量多、流速快、微循環血容量大、結構紊亂、滲透性高等特點[10-11]。

以上特點構成了腫瘤微循環在時空上不平衡，其中乳腺癌良性腫瘤血管形成相對成熟，其微血管密度略高于正常血管，滲透性明顯低于惡性腫瘤。針對以上區別采用T1加權DCE-MRI分析異常腫瘤微循環系統可有效動態監測對比劑在腫瘤微循環中吸收、分布以及代謝消除等藥動學過程，通過藥動學參數評估定量評估腫瘤血管情況，從而診斷良性、惡性腫瘤。

本次研究結果顯示惡性組患者Ktrans、Kep、Ve均顯著高于良性組患者(P<0.05)，與竇瑞雪報道一致[12]，乳腺癌患者DCE-MRI定量參數隨著腫瘤惡性程度增加而增加。分析認為乳腺癌新生血管迅速增加，引起微循環系統結構紊亂和動靜脈瘺的產生，從而造成血管內皮不完整，血管壁薄而脆，管徑增粗，血管基底膜減少可升高血管通透性，注射對比劑后可迅速分布，由于惡性程度增加，腫瘤中微循環系統運轉更加流暢，故而對比劑分布更加迅速，容量轉移、分布速率等相關常數明顯增加[13-14]，其中良性病變膠原纖維增生可增加細胞外血管外間隙結構致密性，阻滯對比劑流通，故而表現為良性腫瘤患者定量常數明顯小于惡性腫瘤。研究認為當惡性腫瘤患者Ktrans、Kep均明顯增加時兩者比值(Ve)并未明顯增加，故而使得良性、惡性腫瘤患者Ve值重疊影響醫師判斷[12]。本次研究發現3.0T DCE-MRI診斷乳腺良性、惡性病變的敏感度特異度約為80%，作為單一診斷效能稍顯不足，故而在實際臨床診斷過程中需配合聯合診斷以提高診斷效能。

圖4 ROC曲線分析

腫瘤標記物因其特異性已逐步成為早期腫瘤篩查重要指標，例如越來越多研究發現微小RNA(microRNA)參與腫瘤發生與發展且腫瘤基因突變累積，microRNA可在血液系統、實體瘤中檢測到其異常表達[15]，如micro RNA21在肺癌、胃癌以及乳腺癌中高表達，通過作用于骨形態發生蛋白通路相關基因、P53等基因促進腫瘤細胞增殖以及抑制細胞凋亡[6]。金屬硫蛋白-1E也在乳腺癌中高表達，其外周血表達水平與腫瘤淋巴結轉移、分化程度、臨床分期等存在相關性。本次研究研究結果顯示惡性組患者micro RNA21、金屬硫蛋白-1E水平顯著高于良性組(P<0.05)，表明隨著腫瘤惡性程度的增加，其表達水平存在增加趨勢。Pearson相關性分析結果顯示Ktrans、Kep、Ve分別與外周血micro RNA21、金屬硫蛋白-1E水平具有正相關性(P<0.05)，故而外周血腫瘤標志物水平也可反應腫瘤血管活躍程度。micro RNA21并不是乳腺癌特異性標志物，因此用于乳腺良性、惡性病變判斷仍需要結合臨床治療或者其他腫瘤標志物。本次研究以組織病理學檢查判斷為金標準，ROC曲線分析結果顯示外周血micro RNA21、金屬硫蛋白-1E診斷惡性病變的AUC(95% CI)為0.872(0.816～0.928)、0.838(0.773～0.902)，均高于0.8，表明具有較好診斷價值。同時，MicroRNA21、金屬硫蛋白-1E以及3.0T DCE-MRI聯合診斷敏感度(92.5%)、陰性預測率(88.1%)以及準確率(90.4%)均明顯高于單獨檢測，表明聯合診斷可顯著提高診斷效能。3.0T DCE-MRI定量參數可反映腫瘤新生血管情況，腫瘤惡性病變會誘導內皮細胞產生間質膠原酶、纖溶酶原激活物等，增加毛細血管壁通透性，豐富的血供保證了充分營養物質和氧氣，微血管密度明顯增加，故而可在一定程度上代替組織學檢查[16-17]。結合血清micro RNA21、金屬硫蛋白-1E水平，從分子生物學角度解釋腫瘤細胞惡性情況，評估腫瘤細胞浸潤、轉移潛力如淋巴結轉移患者、高分化程度患者金屬硫蛋白-1E高于未轉移者或者低分化患者[18]，三者之間互補性有效降低單一指標造成的漏診率、誤診率，指導醫師診斷乳腺癌患者，對于治療方案制定以及患者生存質量和遠期生存率具有重要臨床價值。

綜上所述，乳腺癌患者外周血micro RNA21、金屬硫蛋白-1E高表達與3.0T DCE-MRI定量參數具有相關性，三者聯合檢查對于乳腺良惡性病變診斷有重要臨床價值。