金黃色葡萄球菌骨髓炎發(fā)病機制的研究進展

文強強，劉巖，蘇子龍，于鐵成

(吉林大學第一醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，吉林 長春 130021)

金黃色葡萄球菌作為一種機會性致病菌，可導致包括骨感染在內(nèi)的多種感染性疾病。在臨床上，金黃色葡萄球菌是骨感染最主要的致病菌[1-2]。骨組織在感染金黃色葡萄球菌后如果不能及時得到治療，感染便會很快轉(zhuǎn)變?yōu)槁裕⑶液茈y徹底治愈，造成反復感染。這與金黃色葡萄球菌感染骨組織的特點密切相關。首先，金黃色葡萄球菌在感染骨組織后可以接觸成骨細胞并內(nèi)化進入細胞內(nèi)長期存活，在這期間它會對骨組織造成嚴重的破壞。其次，金黃色葡萄球菌可以在病灶內(nèi)或者植入物表面形成細菌生物膜。細菌的內(nèi)化和生物膜的形成使得機體免疫和抗生素不能徹底清除細菌，使急性感染轉(zhuǎn)變?yōu)槁苑磸透腥尽Ｒ虼司唧w的了解這兩大特點是很有必要的，因為這將有助于選擇合適的治療措施去干擾骨感染的病理進程，從而徹底治愈骨髓炎。

1 金黃色葡萄球菌內(nèi)化進入成骨細胞

金黃色葡萄球菌感染骨組織后能夠接觸并內(nèi)化進入成骨細胞，并在成骨細胞中持久存活，從而實現(xiàn)對機體免疫系統(tǒng)的逃避，對成骨細胞和破骨細胞產(chǎn)生各種影響，當成骨細胞被死亡或凋亡后，其內(nèi)的細菌又會重新釋放到組織間隙中感染別的正常成骨細胞，從而造成反復感染。

金黃色葡萄球菌能夠內(nèi)化進入成骨細胞與其表面的細胞壁錨定(cell wall anchored，CWA)蛋白密切相關[3]。在這些CWA蛋白中，黏附性基質(zhì)分子表面識別因子是最大的一類，其中涉及內(nèi)化黏附過程的主要包括膠原黏附素(collagen adhesin，Cna)、骨唾液蛋白結(jié)合蛋白(bone sialo protein binding protein，Bbp)、Map(MHC Ⅱ analog protein，一種與哺乳動物MHC Ⅱ類分子類似的功能性蛋白)和纖連蛋白結(jié)合蛋白(the fibronectin binding proteins，F(xiàn)nBPs)[4]。金黃色葡萄球菌主要是通過CWA蛋白黏附到成骨細胞表面的，然而這種黏附不是直接的，是通過骨細胞外基質(zhì)(bone extracellular matrix，BEM)間接進行的(見圖1)。BEM是金黃色葡萄球菌感染中的一個重要的角色，它由成骨細胞產(chǎn)生，并且為金黃色葡萄球菌集中在成骨細胞附近創(chuàng)造了條件。BEM中與內(nèi)化黏附有關的成分主要包括I型膠原、骨唾液蛋白、骨橋蛋白和纖維連接蛋白。

金黃色葡萄球菌表面的Cna主要與Ⅰ型膠原結(jié)合，Bbp與骨唾液蛋白結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌中Cna和Bbp基因的存在是植入相關性骨髓炎分離物毒性的主要指標[4]。金黃色葡萄球菌的Map(MHC Ⅱ analog protein，一種與哺乳動物MHC Ⅱ類分子類似的功能性蛋白)在骨髓炎中的作用可能與骨橋蛋白的結(jié)合有關[5]。纖維連接蛋白是金黃色葡萄球菌和成骨細胞之間的橋梁。一方面，金黃色葡萄球菌表面的FnBPs與纖維連接蛋白結(jié)合；另一方面，纖維連接蛋白通過整合蛋白α5β1連接到成骨細胞上[6]。FnBPs通過I型膠原與α5β1整合蛋白結(jié)合，是金黃色葡萄球菌通過細胞內(nèi)攝作用進入成骨細胞內(nèi)部的主要途徑[7]。

金黃色葡萄球菌內(nèi)化進入成骨細胞后可以在其內(nèi)長期存活，這主要與兩個因素有關[4](見圖2)。第一，囊泡逃逸。金黃色葡萄球菌的內(nèi)化在巨噬細胞中高于成骨細胞，但在成骨細胞中存活的金黃色葡萄球菌的比例高于巨噬細胞。這是因為作為非專業(yè)的吞噬細胞，其不具有清除囊泡內(nèi)細菌的能力，而進入成骨細胞內(nèi)金黃色葡萄球菌可以躲在囊泡里，以成功的避免溶酶體的蛋白水解酶的處理，使得金黃色葡萄球菌可以在成骨細胞內(nèi)存活很長時間[8]。第二，小菌落變異體(small colony variants，SCVs)。金黃色葡萄球菌在內(nèi)化進入細胞后，為了躲避機體免疫系統(tǒng)的攻擊，它們會從野生侵襲型轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^小的SCVs型。SCVs是一種生長緩慢的細菌亞群，其細胞壁更厚，具有更高的細胞內(nèi)持久性，對抗生素的敏感性更低，這可能與其有較低的細胞毒性有關[9]。雖然SCV分泌較少的毒性因子，但其表面的CWA蛋白卻是過量表達的[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的SigB基因與SCVs的形成[10]密切相關，而很早以前就發(fā)現(xiàn)SigB基因與生物膜的成熟[11]也有關系。此外，SCVs在離開原來的細胞并感染新的細胞時會迅速恢復為完全的野生的高毒性侵襲型[12]，這也從另一方面解釋了慢性骨髓炎患者為什么會反復感染。

金黃色葡萄球菌感染成骨細胞后，成骨細胞便會分泌細胞因子、趨化因子和生長因子等炎性因子來參與免疫反應，雖然這些炎性因子一定程度上有對抗細菌入侵的作用，但過多的分泌可能會破壞免疫系統(tǒng)的平衡，從而導致骨破壞[13]。成骨細胞不僅能參與炎癥反應，同時還可以釋放α防御素、β防御素和相關分子的抗菌肽(antimicrobial peptides，APs)來抵御金黃色葡萄球菌的入侵[14]。因此，外源性APs的使用可能是治療金黃色葡萄球菌感染相關性骨髓炎的一種新的有效方法，此外，它們還可以被添加到類似鈦合金的支架中，從而擴大了它們用于對抗植入性骨髓炎的用途[4]。

圖1 金黃色葡萄球菌黏附階段的示意圖 圖2 金黃色葡萄球菌進入成骨細胞過程示意圖

2 細菌生物膜的形成

骨髓炎抗生素難治的另一個原因便是細菌生物膜的存在。細菌生物膜的形成是細菌適應生存環(huán)境的兩種方式之一，另一種表現(xiàn)形式是以浮游細胞的形式存在。在實驗室培養(yǎng)基中，由于營養(yǎng)條件充分，細菌主要是以浮游細胞的形式存在的，但在體內(nèi)的實際感染過程中，特別是當有植入物時營養(yǎng)條件往往是不充分的，這時細菌便會形成生物膜[15]，它將細胞包裹在一種粘性基質(zhì)中，便于其在惡劣極端的環(huán)境中生存。生物膜由細菌外多糖和外源性物質(zhì)(多糖、蛋白質(zhì)、礦物晶體、細胞外DNA等)組成[16]，在不同的金黃色葡萄球菌分離株中發(fā)現(xiàn)，其生物膜的成分比例是不同的[17]，但最主要的成分是多糖細胞間粘附素(polysaccharide intercellular adhesin，PIA)，其也是生物膜形成黏附和聚集階段最重要的物質(zhì)基礎，是由icaADBC位點的基因構(gòu)成的操縱子合成的[18]。

細菌形成生物被膜是一個動態(tài)的過程，主要可分為四個階段：細菌可逆性粘附的定殖階段、不可逆性粘附的集聚階段、生物被膜成熟階段和細菌的脫落與再定植階段[19](見圖3)。也有一些文獻把這一過程分為3個階段[20]或5個階段[21]，但其本質(zhì)并沒有什么區(qū)別，只是個別過程的細化或概括。在最初的附著過程中，單個浮游細菌會可逆地與組織或植入物表面結(jié)合，如果細胞長時間不被游離，黏附就會進入不可逆階段。金黃色葡萄球菌生物膜形成黏附階段也與細菌表面的CWA和BEM中的相關成分有關[22]，這一過程與細菌內(nèi)化過程中的黏附階段極為相似，也是通過細胞外基質(zhì)中的成分發(fā)揮作用的。其中一些蛋白如FnBPs、ClfB和SdrC蛋白不僅在黏附階段起作用，在隨后細菌增殖的過程中也發(fā)揮著重要的作用[21]。但是和機體組織表面生物膜的形成相比，發(fā)現(xiàn)植入物表面的生物膜黏附與CWA蛋白的關系并不是太大[21]。植入物表面生物膜的黏附形成不僅依靠細胞外基質(zhì)中成分發(fā)揮中介作用，也依靠范德瓦爾斯力、靜電和空間相互作用力的作用[23]。生物膜的成熟是通過細胞分裂和細胞外聚合物基質(zhì)的產(chǎn)生來實現(xiàn)的。隨著生物膜的積累，生物膜內(nèi)會累積大量的代謝廢物，并且營養(yǎng)物質(zhì)也會耗竭，這時，生物膜便會啟動自我降解程序，群體感應系統(tǒng)、促降解酶和其他特殊化合物會降解生物膜中細胞外多糖、細胞外蛋白質(zhì)和eDNA等成分，造成細胞膜破裂，其內(nèi)的細菌再次恢復到浮游狀態(tài)進行擴散，從而造成反復的感染[18]。同時這也給了生物膜的清除治療一定的啟示，是否可以人工促進生物膜降解同時配合抗生素的治療。

生物膜可有效保護細菌免受機體免疫和抗生素的清除。發(fā)現(xiàn)巨噬細胞等免疫細胞很難通過生物膜，這就使得機體免疫受阻[24]。生物膜的耐藥性主要有兩種機制：其一，生物膜本身可以阻止抗生素進入其內(nèi)部；其二，與細胞內(nèi)的SCVs相似，生物膜內(nèi)的細菌也會形成一種保守的低毒性的表型，其代謝比野生型細菌低，對抗生素有很強的抵抗力[18]。要想抑制生物膜的形成或者清除已經(jīng)形成的生物膜，那么抗生素治療劑量可能需要達到平時的數(shù)倍或數(shù)十倍。比如對于萬古霉素，其最低抑制生物膜形成濃度(minimumbiofilminhibition concentrations，MBIC)是其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)的2～8倍，而最低清除生物膜濃度(minimum biofilm eradication concentrations，MBEC)至少是其MIC的16倍。對于利奈唑胺，單其MBIC就是MIC的32倍[20]，而抗生素如果達到MBIC和MBEC的量，將會對機體產(chǎn)生巨大的毒副作用。而大多數(shù)治療量的抗生素，其只能在生物膜形成的早期階段進入生物膜內(nèi)殺死細菌，并且這段時間僅持續(xù)幾天時間[25]。

a 可逆性黏附的定殖階段 b 不可逆性黏附的集聚階段 c 生物被膜成熟階段階段 d 細菌的脫落與再定植階段

3 骨質(zhì)破壞

金黃色葡萄球菌對骨組織最主要的影響是能夠造成嚴重的骨質(zhì)流失，造成骨質(zhì)破壞，這種現(xiàn)象的原因是由于成骨細胞和破骨細胞之間的不平衡所引起的。成骨細胞和破骨細胞分別負責骨形成和骨吸收，這對于骨穩(wěn)態(tài)非常重要。無論是哪一方面出現(xiàn)問題，都會破壞正常骨穩(wěn)態(tài)環(huán)境。成骨細胞可以分泌產(chǎn)生NF-κB的配體受體激活蛋白(receptor activator of NF-k B ligand，RANK-L)和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)，并以此來調(diào)節(jié)破骨細胞的生成，RANK-L/OPG比值過高便會刺激破骨細胞的生成，相反破骨細胞的生成便會減少[26]。

在金黃色葡萄球菌造成的骨感染中，成骨細胞活性降低，最后會凋亡和死亡，骨形成減少；相反，破骨細胞活性增強，骨吸收增加，從而導致骨質(zhì)流失，骨質(zhì)破壞。這一骨質(zhì)的變化不僅發(fā)生在細菌內(nèi)化過程中[4]，也會發(fā)生在生物膜形成階段[27]。這提示骨感染骨質(zhì)的破壞是這兩方面共同作用的結(jié)果，而不是單因素造成的。以浮游形式存在的細菌或內(nèi)化過程中的細菌對成骨細胞產(chǎn)生的影響主要是由于其表面的毒力因子引起的[28]，而生物膜對成骨細胞的影響主要是通過其產(chǎn)生的可溶性因子發(fā)揮作用的[27]。同時發(fā)現(xiàn)兩者都是通過提高RANK-L/OPG的比值，刺激破骨細胞的生成[27，29-30]，從而造成骨質(zhì)流失。

4 骨感染治療的展望

目前，骨感染的治療主要遵循三個基本原則[31]：(1)抗生素的應用；(2)局部外科清創(chuàng)；(3)使用輔助治療。由于抗生素很難進入細胞和生物膜內(nèi)，難以徹底清除細胞和生物膜內(nèi)的細菌，這就導致了耐藥菌的產(chǎn)生以及骨感染的反復發(fā)作。徹底清除感染組織是治療的關鍵，如果手術清創(chuàng)范圍過小，則不能達到徹底清除壞死病灶的目的，會殘留細菌在體內(nèi)，有復發(fā)的可能；而清創(chuàng)范圍過大則會對患者造成巨大的傷害，使患者的生活質(zhì)量大大降低[32]。輔助治療如高壓氧等，是一種輔助療法，只能配合其他治療手段使用。這就導致目前臨床上骨感染難以徹底治愈的局面，因此，迫切需要開發(fā)新的治療方法來治療這種頑固性疾病。由于骨感染中阻礙治療的主要是細菌內(nèi)化和生物膜的存在，那么針對這兩點的治療將會給予骨感染治療新的希望。

對于金黃色葡萄球菌的內(nèi)化，由于CWA蛋白在其黏附階段和內(nèi)化階段都發(fā)揮著重要的作用，因此預防階段可以使用針對CWA蛋白的重組疫苗[3]進行預防。而對于已經(jīng)內(nèi)化進入細胞內(nèi)的細菌，現(xiàn)階段研究的熱點主要是研制各種措施增加抗生素進入細胞內(nèi)的量，比如納米粒子顆粒負載抗生素的應用[33]，有研究發(fā)現(xiàn)其也能穿透細菌生物膜[34]。同時發(fā)現(xiàn)沙氏菌蛋白酶可以減少金黃色葡萄球菌對成骨細胞的侵襲內(nèi)化作用[35]。

對于生物體組織表面生物膜的形成，由于其黏附和金黃色葡萄球菌表面的CWA蛋白密切相關，因此也可以給予重組的CWA蛋白疫苗。而對于預防植入物表面生物膜的形成，可以應用一些表面涂有特殊抗菌涂層或抗黏附涂層的醫(yī)用新型植入物[36]。雖然單種抗生素應用很難對抗生物膜，但研究發(fā)現(xiàn)多種抗生素的聯(lián)合應用對生物膜有很好的治療效果[37]。最近發(fā)現(xiàn)一些抗菌肽的衍生物對生物膜也有作用[38-40]。植物乳酸桿菌分泌的脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)不僅可以抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，還可以破壞預先形成的生物膜[41]。此外，一些物理方法和抗生素的聯(lián)合應用也發(fā)現(xiàn)對生物膜的形成或清除有一定的作用，比如納米粒子顆粒[34]、沖擊波[42]和光動力療法[43]等。

綜上所述，雖然以上針對細菌內(nèi)化和生物膜的治療大多仍處于實驗階段，并沒有進入臨床，但這些治療方法在未來的應用將會把骨感染治療提上一個新的高度。