泡桐花總黃酮含量測定方法研究

呂亭亭，楊志華，謝 奇，葉翩翩，陶 娟，劉 旭*

(1.江蘇護理職業學院藥學與中藥學院，江蘇 淮安 223005；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381)

泡桐(Paulowniafortunei)，多年生落葉喬木，是玄參科泡桐屬的簡稱。我國泡桐資源豐富，種類繁多，在黃河流域被用作傳統醫藥數百年[1]。由于泡桐具有易繁殖、生長速度快、材質較好的特點，已被許多國家引種栽培，主要應用于生態綠化和工農業生產。泡桐不但具有較高的經濟價值而且具有重要的藥用價值，泡桐植物的根、花、葉、皮、果均可入藥，具有抗氧化[2]、抗菌[3-4]、抗病毒[5]等藥理活性。泡桐花(PaulowniaFlos)即為泡桐的花，主要含有黃酮類、苯丙素類、萜類、糖類等活性成分，具有清熱解毒、疏風散熱、燥濕止痢、清肝明目之功效[6-7]。泡桐花總黃酮具有抗菌[8]、抗炎[9]、抗病毒[10-11]、抗氧化[12]、增強免疫力[13]等生物活性，受到人們的廣泛關注。目前，測定植物中總黃酮含量的方法主要有高效液相色譜法和比色法[14]，其中高效液相色譜法操作繁瑣，主要用于測定黃酮單體，不適于總黃酮的含量測定；而亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法和三氯化鋁比色法由于操作簡單、實用性強，在總黃酮含量測定中被廣泛使用[15-17]。

作者以蘆丁為對照品，通過比較亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系和三氯化鋁顯色體系對總黃酮的吸收特性，篩選泡桐花總黃酮含量測定的合適方法，并對該方法進行方法學驗證；在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗對該方法的顯色時間進行優化，為泡桐花總黃酮含量測定方法的研究提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

泡桐花，購自河南蘭考中草藥市場，經鑒定屬玄參科泡桐屬植物。用多功能粉碎機粉碎成300 目，備用。

蘆丁對照品(純度≥98%)，合肥博美生物科技有限責任公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁等均為分析純，無錫亞盛化工有限公司。

BF-10型多功能粉碎機，河北本辰科技有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；BSA型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 溶液的制備

1.2.1 顯色試劑的配制

5%NaNO2溶液：稱取亞硝酸鈉2.5 g，溶于50 mL蒸餾水中。

10%Al(NO3)3溶液：稱取硝酸鋁5 g，溶于50 mL蒸餾水中。

1.0 mol·L-1NaOH溶液：稱取氫氧化鈉4.0 g，溶于100 mL蒸餾水中。

0.1 mol·L-1AlCl3溶液：稱取三氯化鋁1.34 g，溶于100 mL蒸餾水中。

1.2.2 對照溶液的配制

取蘆丁對照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解，定容至刻度，即得200 μg·mL-1對照溶液。

1.2.3 供試溶液的制備

稱取泡桐花粉末2.0 g，置于圓底燒瓶中，加入60%乙醇50 mL，90 ℃加熱回流提取2.0 h，冷卻，補重，離心，取20 mL上清液，用60%乙醇稀釋至50 mL，即得供試溶液。

1.3 泡桐花總黃酮含量測定方法的篩選

1.3.1 亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[18-19]

精密量取供試溶液1.00 mL和對照溶液2.00 mL，分別置于燒杯中；各加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；再各加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；最后各加3.0 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液，用蒸餾水定容至10 mL，靜置15 min；以空白試劑作為參比，用紫外可見分光光度計在400～600 nm波長范圍內掃描吸收曲線。

1.3.2 三氯化鋁比色法[20]

精密量取供試溶液1.00 mL和對照溶液2.00 mL，分別置于燒杯中；各加入2.0 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，靜置30 min；以空白試劑作為參比，用紫外可見分光光度計在300～500 nm波長范圍內掃描吸收曲線。

1.4 顯色時間的優化

1.4.1 單因素實驗[16,19,21]

前期實驗發現，3種顯色試劑NaNO2、Al(NO3)3、NaOH的加入比例約為1∶1∶10。所以，測定泡桐花總黃酮含量時只要控制好3種顯色試劑的加入比例即可，試劑的加入量對吸光度的影響不大。為此，只需考察3種顯色試劑的靜置時間(顯色時間)對吸光度的影響。量取2 mL供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定泡桐花總黃酮含量，考察NaNO2顯色時間(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)、Al(NO3)3顯色時間(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)、NaOH顯色時間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)對吸光度的影響。

1.4.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選取NaNO2顯色時間(A)、Al(NO3)3顯色時間(B)、NaOH顯色時間(C)作為考察因素，以泡桐花總黃酮含量為考核指標進行3因素3水平L9(34)正交實驗，優化泡桐花總黃酮含量的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定條件。正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平

2 結果與討論

2.1 泡桐花總黃酮含量測定方法的確定

分別采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系和三氯化鋁顯色體系對供試溶液和對照溶液進行顯色，用紫外可見分光光度計在一定波長范圍內掃描吸收曲線，結果如圖1所示。

從圖1可知，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，對照溶液和供試溶液的吸收峰幾乎重合，最大吸收波長為500 nm；采用三氯化鋁顯色體系，對照溶液和供試溶液的最大吸收波長差異較大。因此，選擇亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定泡桐花總黃酮含量，檢測波長為500 nm。

圖1 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系(a)和三氯化鋁顯色體系(b)的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of solutions colored by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH chromogenic system(a) and AlCl3 chromogenic system(b)

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線及線性范圍

精密量取對照溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計測定500 nm處吸光度，以蘆丁溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線(圖2)，擬合得線性方程為y=9.315x-0.0353，R2=0.9998。表明蘆丁濃度在0.02～0.10 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

圖2 蘆丁的標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.2.2 重復性

分別稱取6份泡桐花樣品各2.0 g，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計測定500 nm處吸光度，每個樣品平行測定3次，取平均值。計算泡桐花總黃酮含量分別為3.66%、3.71%、3.76%、3.64%、3.68%、3.72%，平均含量為3.70%，RSD為1.08%，小于3.0%，表明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法重復性良好。

2.2.3 精密度

稱取泡桐花樣品2.0 g，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計測定500 nm處吸光度，連續測定6次。計算泡桐花總黃酮含量分別為3.52%、3.63%、3.67%、3.53%、3.64%、3.66%，平均含量為3.61%，RSD為1.67%，小于3.0%，表明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法精密度良好。

2.2.4 穩定性

稱取泡桐花樣品2.0 g，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，分別在0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min取樣，用紫外可見分光光度計測定500 nm處吸光度，每個樣品平行測定3次，取平均值，分別為0.528 0、0.527 2、0.526 8、0.526 1、0.521 2、0.518 1、0.512 0。表明泡桐花樣品溶液采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系顯色后吸光度在0～30 min內穩定性良好。

2.2.5 準確度

分別稱取6份泡桐花樣品各2.0 g，分別加入0.076 2 g蘆丁對照品，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計測定500 nm處吸光度，每個樣品平行測定3次，取平均值，計算泡桐花總黃酮的加標回收率及RSD，結果見表2。

從表2可知，泡桐花總黃酮的加標回收率在99.2%～105.5%之間，RSD為2.18%，小于3.0%，表明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法準確度良好。

表2 泡桐花總黃酮的加標回收率

2.3 顯色時間優化

2.3.1 單因素實驗結果

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定泡桐花總黃酮，3種顯色試劑的顯色時間對吸光度的影響見表3。

表3 3種顯色試劑的顯色時間對吸光度的影響

從表3可知，加入不同顯色試劑后，隨著顯色時間的延長，吸光度均逐漸減小并趨于穩定。在加入顯色試劑NaNO2、Al(NO3)3、NaOH后，分別靜置6 min、6 min、15 min后吸光度穩定。

2.3.2 正交實驗結果

根據單因素實驗結果，分別以6 min、6 min、15 min為NaNO2顯色時間(A)、Al(NO3)3顯色時間(B)、NaOH顯色時間(C)的中心點，采用L9(34)正交實驗優化亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法顯色條件，結果與分析見表4。

從表4可知，因素A對總黃酮含量影響最大，其次是因素B，影響最小的是因素C；測定泡桐花總黃酮含量的最佳顯色條件為A2B2C1，即NaNO2顯色時間6 min、Al(NO3)3顯色時間6 min、NaOH顯色時間10 min。

2.4 泡桐花總黃酮含量的測定

分別稱取6份泡桐花樣品各2.0 g，按1.2.3方法制備樣品溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系在優化條件下進行顯色反應，用紫外可見分光光度計測定500 nm處吸光度，每個樣品平行測定3次，取平均值，計算泡桐花總黃酮的平均含量為3.78%，RSD為2.05%。說明該方法測定泡桐花總黃酮穩定可行。優化的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法簡便、快速、準確，可作為泡桐花總黃酮含量的測定方法。

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗確定亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定泡桐花總黃酮較為合適，該方法的重復性、精密度、穩定性和準確度均較好，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等3種顯色試劑的最佳顯色時間分別為6 min、6 min、10 min，在此條件下測定的泡桐花總黃酮平均含量為3.78%，RSD為2.05%。