酸堿處理去除血液制品中熱原工藝的探索

李常祿

摘? 要：目的是對(duì)酸堿處理去除血液制品中熱原工藝進(jìn)行探索和研究。方法是通過(guò)調(diào)整高熱源制品的plH、離子強(qiáng)度蛋白濃度等參數(shù)，使用不同的溫度和不同的時(shí)間對(duì)熱源的變化進(jìn)行觀察。結(jié)果當(dāng)pHIO或pH4被孵放一定的時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)毒素明顯降低的現(xiàn)象，其中，在使用鱟試法和家免法對(duì)經(jīng)過(guò)pHI10.37C孵放的人血白蛋白（HAS）制品進(jìn)行檢測(cè)后，結(jié)果為熱源以及其他指標(biāo)均為合格，都達(dá)到了現(xiàn)行的要求。結(jié)論使用酸堿處理法對(duì)血液制品中的熱源是十分經(jīng)濟(jì)且有效的方法。

關(guān)鍵詞：酸堿處理;血液制品;熱原質(zhì)

血液制品是各種血漿蛋白制品的統(tǒng)稱，比如胎盤血白蛋白、人血白蛋白以及靜脈注射的人免疫球蛋白等都屬于血液制品。制作成血液制品的原料為健康的人血漿，一個(gè)健康的人血漿和蛋白質(zhì)在血液中的比例分別為92%和7%左右而血液制品則是通過(guò)對(duì)血液中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取分離。但是由于在自然環(huán)境中存在很多的熱源質(zhì)，熱源質(zhì)會(huì)對(duì)很多大規(guī)模的血液蛋白分離技術(shù)產(chǎn)生影響，會(huì)受到熱源污染的影響產(chǎn)生熱源反應(yīng)，熱源是一種毒性反應(yīng)物質(zhì)，其中美藥理性很強(qiáng)，會(huì)對(duì)血液制品造成一定的影響和破壞。

1 對(duì)熱源的處理方法分類

本文將會(huì)深入研究去除血液制品中熱原的方法，其中一類方法是針對(duì)不同細(xì)菌內(nèi)部的相對(duì)分子的質(zhì)量來(lái)去除細(xì)菌內(nèi)的毒素，這種情況可以使用分子篩或者是使用超濾的方法進(jìn)行去除處理。一般情況下這種方法主要是應(yīng)用于低分子量的輸液藥品中，針對(duì)注射型藥物所使用的方法有兩種，一種是使用各種層析法，這種方法使用的范圍較廣并且十分的有效，不過(guò)該該方法所需要的設(shè)備比較昂貴，不能對(duì)數(shù)量較大的藥品進(jìn)行處理;另外一種的方法是使用酸堿氧化劑的化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行處理。這種化學(xué)方法的效果也十分的有效，不過(guò)該方法對(duì)制品有一項(xiàng)要求即該制品對(duì)化學(xué)條件具有一定的穩(wěn)定性。在本次的研究中主要是使用酸堿的化學(xué)方法，研究的方法結(jié)果如下文所示。

2 材料與方法

2.1 主要試劑

內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;鱟試劑為福建省福州東方鱟試劑廠產(chǎn)品，其靈敏度為0.5EU/ml;人血白蛋白及免疫球蛋白由本所血液制劑室提供。

2.2 酸堿對(duì)溶液中內(nèi)毒素的影響

將注射用生理鹽水分成2份，分別用1mol/LHCI或1mol/L NaOH調(diào)pH至4.0+0.5、10+0.5，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，使內(nèi)毒素濃度為4EU/ml，除菌過(guò)濾后分成4份，分別放在57+0.5C、37土0.59、20+0.5C、（2～8）土0.5C孵放，在不同的時(shí)間取樣，用鱟試法測(cè)其內(nèi)毒素含量。

2.3 堿處理去除熱原的最佳條件

將20%的人血白蛋白制品（鱟試法和家兔法檢測(cè)熱原均合格）用注射用水稀釋，使其蛋白濃度為10%，用1mol/L NaOH調(diào)pH到10.0+0.2，再加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，使其濃度為4EU/ml之后分成3份，將其中2份的Na+濃度調(diào)為40mmol/L，除菌過(guò)濾后分別置于37+0.5C、57+0.5C孵放。另一份調(diào)Na*濃度為160mmo/L，除菌過(guò)濾后37土0.5C孵放，不同時(shí)間取樣用特異性鱟試劑（去C*因子）凝膠法測(cè)其內(nèi)毒素含量。并對(duì)樣品進(jìn)行HPLC、電泳及外觀等的分析。

2.4 堿處理法復(fù)制3批高熱原人血白蛋白

將20%人血白蛋白用注射用水稀釋至10%，用1mol/L NaOH調(diào)pH到10.0士0.2，除菌過(guò)濾后37C孵放，不同時(shí)間取樣用特異性鱟試劑（去C*因子）凝膠法（TAL）測(cè)其內(nèi)毒素含量。孵放后TAL陰性的制品再用家兔法驗(yàn)證，并對(duì)制品進(jìn)行全檢。

2.5 酸孵放對(duì)靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）中內(nèi)毒素的影響

在5%的低pH（pH4t0.2）靜脈注射丙種球蛋白中，分別按5EU/ml及2.5EU/ml的量加入內(nèi)毒素，搖勻后取樣，采用家兔法檢測(cè)熱原，另將樣品于24士1C孵放24d，同樣用家兔法檢測(cè)熱原。

3 結(jié)果

3.1 酸堿處理對(duì)生理鹽水中內(nèi)毒素的去除效果

將內(nèi)毒素濃度為4EU/ml的生理鹽水樣品置于pH（4、10）且溫度不同的地方進(jìn)行孵放，在對(duì)該樣品分別在不同的時(shí)間利用鱟試法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為：樣品在pH4且在不同的溫度中進(jìn)行孵放，時(shí)間均在24小時(shí)之內(nèi)，這時(shí)其內(nèi)毒素含量出現(xiàn)了快速的下降，時(shí)間到達(dá)35小時(shí)后，其濃度下降至1EU/ml;當(dāng)樣品在pH10時(shí)，顯示的結(jié)果為孵放溫度越高，內(nèi)毒素的下降速度越快，當(dāng)溫度為57度時(shí)，時(shí)間為35小時(shí)后下降為陰性，當(dāng)溫度為37度時(shí)孵放的時(shí)間到達(dá)76小時(shí)時(shí)下降為陰性，其檢測(cè)的結(jié)果如下圖1和圖2所示。

3.2 堿處理對(duì)人血白蛋白中內(nèi)毒素去除效果

含4EUml內(nèi)毒素的10%人血白蛋白，在pH10條件下，57C孵放24h、37C孵放48h經(jīng)鱟試驗(yàn)檢測(cè)均為陰性，且鈉離子濃度對(duì)內(nèi)毒素的降解作用無(wú)影響，見圖3。另外，堿處理前后制品的HPLC及PACE電泳圖譜無(wú)差異。堿處理前制品多聚體含量為1.42%，單體加雙體為98.58%;經(jīng)pH10、37C孵放多聚體含量為1.39%，單體加雙體為98.61%。

3.3 堿處理法復(fù)制高熱原人血白蛋白的效果

堿處理（pH10、37C）3批高熱原人血白蛋白制品，第6天家兔法和鱟試法檢測(cè)其熱原均合格，且其余各項(xiàng)檢定指標(biāo)均符合現(xiàn)行《中國(guó)生物制品規(guī)程》要求。

4 討論

經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行以下總結(jié)，當(dāng)酸堿程度在pH4和pHI0的條件下，細(xì)菌中的內(nèi)毒素可以被充分的去除從而達(dá)到降低血液制品中熱源的目的。而酸堿條件之間進(jìn)行比較可以得出，堿性條件會(huì)比酸性條件去除熱源的規(guī)律性更強(qiáng)，也具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，在堿性條件下鈉離子濃度的高低不會(huì)對(duì)處理熱源的效果產(chǎn)生影響。人血白蛋白在PH10和37度的條件下進(jìn)行6天的孵放，其常規(guī)的指標(biāo)并未出現(xiàn)明顯的變化，同時(shí)也達(dá)到了現(xiàn)行的《中國(guó)生物制品規(guī)程》的要求，不過(guò)白蛋白的額結(jié)構(gòu)有無(wú)出現(xiàn)變化并未明確，具體的結(jié)果需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè);當(dāng)處于pH4實(shí)驗(yàn)環(huán)境中時(shí)，對(duì)免疫白蛋白進(jìn)行零處理時(shí)，對(duì)其中一些抗體產(chǎn)生了一些影響，其中白喉抗毒素、抗-HBs的抗體活性并未出現(xiàn)明顯的變化。綜上所述，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后可以得出去除熱源的有效條件為在酸堿度為pH4、溫度為24度時(shí)間為24小時(shí)時(shí)，對(duì)熱源的去除效果最好，可以作為常規(guī)的免疫球蛋白中滅活病毒的方法。

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