酵母葡聚糖的前處理及其對白鰱魚肉的去腥效果

黃晶晶，張慧敏，趙麗媛，熊善柏，黃琪琳

（華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）是生長在中上層溫水的淡水魚，以浮游生物（尤其是浮游植物）為食，具有生長快、抗病性強、產量高、價格便宜等優點[1]。此外，白鰱魚肉中富含優質蛋白（15%～18%魚肉）和多不飽和脂肪酸，肉質細膩易消化[2-4]。但因自身生理條件及生活環境的影響而具有令人不愉快的氣味，主要體現為人們常說的魚腥味，因此不被一些消費者所接受，導致其加工和消費價值降低[5]。

淡水魚中的腥味主要來源于環境中微生物的代謝、不飽和脂肪酸的氧化及酶的催化分解氧化三甲胺產生不良氣味物質[6]。目前，水產品去腥方法主要分為物理法，如利用β-環糊精包埋腥味法[7]；生物法，如發酵去腥法[8]；化學法，如利用茶多酚抑制脂肪氧化[9]等，其中物理化學法有著操作技術較為簡單的特點，且能達到良好的去腥效果。酵母細胞含有大量營養成分，當酵母自溶后，大部分蛋白質、氨基酸和核苷酸可提取制成酵母抽提物。已有研究發現酵母抽提物可利用自身的風味豐富巴非蛤水解液的風味，降低醛酮類物質的相對含量，達到去腥目的[10]。酵母細胞壁則可用于提取一種功能性多糖——酵母葡聚糖，也具有一定酵母風味。本實驗室在前期研究中發現酵母葡聚糖在增強白鰱魚糜凝膠特性的同時，還能夠改善魚糜凝膠的感官品質，有一定消減腥味的作用，但消減機制尚不明確[11]。

因此本研究選擇堿提和熱水洗2 種方式對酵母葡聚糖進行前處理，以白鰱魚肉為研究對象，通過感官評價、電子鼻技術及頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法，研究經過前處理的酵母葡聚糖的添加對白鰱魚肉整體風味的影響及揮發性成分的組成和含量的變化；從氣味吸附和脂肪氧化的角度探究酵母葡聚糖消減白鰱魚肉腥味的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱（約2 kg），購于華中農業大學農貿市場。將活魚帶水運到實驗室，即用。

酵母葡聚糖（β-葡聚糖≥85.0%） 安琪酵母股份有限公司；1,2-二氯苯（色譜純） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、氯化鈉、丙酮、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、2,6-二叔丁基對甲酚（butylhydroxytoluene，BHT）（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

FD-1A-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；DF-101S型磁力攪拌器 鄭州長城工貿有限公司；FOX4000型電子鼻 法國Alpha M.O.S公司；7890B-5977A型氣相色譜-質譜聯用儀 安捷倫科技有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 上海楚定分析儀器有限公司；UV-1750型紫外-可見分光光度計日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母葡聚糖前處理

熱水洗處理：稱取5 g酵母葡聚糖加入1 000 mL蒸餾水中，100 ℃水浴攪拌30 min后離心，取沉淀進行冷凍干燥，得到熱水洗處理的酵母葡聚糖（簡寫為熱水洗YG）。

堿提處理：將5 g未處理的酵母葡聚糖置于索氏提取器中依次用50 mL乙酸乙酯和丙酮分別回流6 h，以除去其中的脂肪。將脫脂后的酵母葡聚糖用150 mL、2 mol/L氫氧化鈉溶液在4 ℃攪拌提取12 h后，4 500 r/min離心10 min，得到的上清液用鹽酸中和至中性后離心，沉淀物先經自來水透析6 d再經蒸餾水透析3 d后冷凍干燥，得到堿提處理的酵母葡聚糖（簡寫為堿提YG）。

1.3.2 酵母葡聚糖揮發性成分測定

分別稱取未處理酵母葡聚糖（對照組）、熱水洗YG和堿提YG 0.06 g于頂空瓶中，加入7 mL飽和氯化鈉溶液和內標物（1,2-二氯苯，1 μg/mL，300 μL），放入微型磁力攪拌轉子，密封，并置于磁力加熱攪拌器中；60 ℃平衡3 min，用已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附50 min；將萃取完全的萃取頭插入氣相色譜-質譜進樣口，解吸5 min。

氣相色譜條件：HP-5MS（5%苯基）甲基硅氧烷毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以50 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃，載氣（He）流量1 mL/min，不分流。

質譜條件：電子電離源；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z35～450。

樣品中各揮發性成分的含量（ci）按式（1）計算：

式中：Ai、Ais分別為各揮發性成分和內標物質的峰面積；Wis、W分別為內標物質量（300 ng）和不同前處理酵母葡聚糖質量（0.06 g）。

1.3.3 感官評價

新鮮白鰱用冰水清洗干凈后“三去”（去頭、去鱗、去內臟），手工采肉，保持魚肉溫度不超過10 ℃，魚肉絞碎后備用；取絞碎后的魚肉，添加2%的酵母葡聚糖混合均勻后備用。

參考付湘晉等[12]的方法并稍作修改。取新鮮魚肉和魚肉-酵母葡聚糖復合物各20 g于棕色試劑瓶中。在30 ℃培養箱中放置30 min。選擇11 名前期經過訓練的感官評定員（年齡在18～35 歲）進行感官分析，選取5 種感官描述詞：青草味、魚腥味、水果味、土霉味、酵母味。以各感官氣味標準品作為對照，采用9 分制進行感官評價，評分標準見表1。

表1 白鰱魚肉感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of silver carp meat

1.3.4 電子鼻分析

分別準確稱取酵母葡聚糖、新鮮魚肉、魚肉-酵母葡聚糖復合物0.04、2、2.04 g于10 mL樣品瓶中，旋蓋密封待測。每個樣品重復測定3 次。

頂空產生參數：產生時間120 s，產生溫度50 ℃；振蕩速率500 r/min；獲得參數：總獲取時間120 s，獲取間隔時間1 s，獲取延滯時間300 s；頂空注射參數：注射體積1.5 mL，注射速率1.5 mL/s；進樣針溫度60 ℃；載氣：合成干燥空氣，流速150 mL/min。

1.3.5 魚肉揮發性成分測定

分別準確稱取新鮮魚肉、魚肉-酵母葡聚糖復合物3、3.06 g于頂空瓶中，加入7 mL飽和氯化鈉溶液和內標物1,2-二氯苯（1 μg/mL，300 μL），放入微型磁力攪拌轉子，密封，并置于磁力加熱攪拌器中。60 ℃平衡3 min，用已活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附50 min；將萃取完全的萃取頭插入氣相色譜-質譜進樣口，解吸5 min。

氣相色譜-質譜測定揮發性成分條件及計算方法同1.3.2節。

特征揮發性成分評價采用氣味活度值（odor activity value，OAV）法，評價不同化合物對樣品總體氣味的貢獻，定義為嗅感物質的絕對含量c（μg/g）與其感覺閾值T（μg/kg）之比，按式（2）計算：

1.3.6 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reaction substrate，TBARS）值測定

將新鮮魚肉、魚肉-酵母葡聚糖復合物和魚肉-BHT（0.05%）復合物（陽性對照）分別在0、25、35、60 ℃放置2 h。準確稱取5.0 g樣品于20 mL 3.75 g/L硫代巴比妥酸-150 g/L三氯乙酸-0.25 mol/L HCl的混合液中，充分混勻后，沸水浴加熱20 min，碎冰冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清液于波長532 nm處測定吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷為標準品制備標準曲線，結果以每千克魚肉中所含質量計。

1.4 數據處理

所有實驗數據以Origin 9.0（Origin-Lab, Northampton,MA, USA）和Excel 2010進行處理，采用SPSS 22.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）進行ANOVA單因素方差分析及Duncan檢驗（P＜0.05），數據以±s表示。

2 結果與分析

2.1 前處理對酵母葡聚糖揮發性成分的影響

表2 不同前處理方式下酵母葡聚糖的揮發性成分分析Table 2 Analysis of volatile components of yeast glucan pretreated by different methods

來源于酵母細胞的酵母葡聚糖會自帶酵母風味[13]。如表2所示，對照組中共檢測出30 種揮發性成分，主要包括醛類10 種、酮類9 種、醇類2 種、酸類2 種、烴類1 種和酯類6 種，其中含量較高的物質有庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、2-壬烯醛、庚醇、2-辛酮、2-壬酮、環辛烷，而辛醛含量最高達到47.59 μg/g，是酵母葡聚糖主要揮發性成分。堿提YG中共檢測到20 種揮發性成分，且大部分物質的含量小于對照，其中辛醛和2-壬烯醛的含量分別減少了31%和62%。而熱水洗YG中共檢測到9 種揮發性物質，主要為醛類8 種、酮類1 種。與對照相比，除2-癸烯醛，其各揮發性成分含量均顯著減少（P＜0.05），其中低閾值的辛醛含量降低到23.97 μg/g，減少了50%，而2-壬烯醛未檢出。

通過以上分析，熱水洗處理和堿提處理均可降低酵母葡聚糖揮發性成分的種類及含量，其中熱水洗處理的效果更顯著，特別是對其風味貢獻較大的辛醛、2-庚烯醛等物質含量降低效果明顯，說明其能很好地去除酵母葡聚糖本身的風味物質，因此選擇熱水洗的處理方式對酵母葡聚糖進行前處理，然后用于后續實驗。

2.2 前處理酵母葡聚糖對白鰱魚肉感官的影響

圖1 酵母葡聚糖對白鰱魚肉氣味的影響Fig.1 Sensory odor profile analyses of silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan

如圖1所示，新鮮白鰱魚肉的氣味主要以魚腥味、青草味、土霉味為主，也有少許的水果味，其中魚腥味最重得分為5.73。魚肉加入熱水洗YG后，魚腥味和青草味明顯降低，分別降至3.82 分和2.27 分，土霉味也有所減弱，表明經熱水洗YG在一定程度上可以降低魚肉整體氣味。

2.3 電子鼻判別前處理酵母葡聚糖對白鰱魚肉氣味的影響

2.3.1 主成分分析（principal components analysis，PCA）結果

PCA是目前常用分析方法，它能夠將幾組數據進行降維，通過線性分類反映出樣品的信息，最終在散點圖上顯示為所需的二維散點圖[11,16]。PCA能夠將不同樣品按照主成分劃分在不同的區域，區域之間的距離表示不同樣品之間的差異，距離越遠，說明不同樣品之間氣味的差異越大[17]。

圖2 酵母葡聚糖處理前后白鰱魚肉PCA圖Fig.2 PCA plots of silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan

由圖2可以看出，PC1貢獻率為96.462%，PC2貢獻率為2.447%，兩者之和為98.909%，說明PC1和PC2包含了樣品的大量信息，可以較好地反映樣品的信息[18]。由圖2可知，3 種樣品的氣味差異主要體現在PC1軸上，且分別分布在不同區域內，樣品之間沒有重疊，說明電子鼻的PCA能夠對新鮮魚肉、魚肉-酵母葡聚糖復合物和酵母葡聚糖的整體氣味進行有效區分。從分布的區域看，酵母葡聚糖樣品與魚肉-酵母葡聚糖復合物樣品之間分布距離較遠，表明它們之間的氣味差異較大，即魚肉-酵母葡聚糖復合物主要以魚肉的氣味為主導；此外，新鮮魚肉與魚肉-酵母葡聚糖復合物分布具有一定的距離，兩者之間沒有重疊，說明添加熱水洗YG確實會對魚肉的整體氣味產生影響，與感官評價結果一致。

判別指數（discrimination index，DI）是電子鼻在進行PCA時表征不同樣品之間的區分程度的一種表征值，當DI位于80～100之間時說明不同樣品之間的區分度良好，且DI越大區分效果越好[19]。由圖2可知，酵母葡聚糖添加前后白鰱魚肉PCA的DI為93，說明PCA法能夠對新鮮魚肉、魚肉-酵母葡聚糖復合物和酵母葡聚糖3 種樣品進行有效區分。

2.3.2 判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA）結果

DFA是在PCA之后，進一步將響應信號數據進行區分，從而可以將不同樣品之間的氣味差異放大[20]。與PCA類似，若DFA的不同組數據分布越分散，說明樣品之間氣味的差異越明顯。與圖2相比，圖3中各組分的差異明顯擴大，且每組樣品的聚集度較為緊密，說明重復性較好。DF1與DF2的貢獻率分別為99.857%和0.143%，累計貢獻率達到100%。說明DFA也能較全面地代表3 個樣品的信息。

圖3 酵母葡聚糖對白鰱魚肉DFA圖Fig.3 DFA plots of silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan

2.4 前處理酵母葡聚糖對魚肉中揮發性成分影響

通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法分析，在新鮮魚肉和魚肉-酵母葡聚糖復合物中分別檢測出23 種和22 種揮發性成分。在白鰱魚肉中加入熱水洗YG后，魚肉中的揮發性物質的含量及數量都有所減少。

2.4.1 醛類化合物

醛類化合物是脂質降解的產物，在揮發性成分中其含量較高且閾值較低，對魚肉的整體風味形成貢獻較大[21]。如表3所示，在新鮮魚肉中共檢測到11 種醛類化合物，且含量相對較高，占總揮發性成分的33.9%，其中己醛含量最高，達到了486.94 μg/kg。有研究報道，己醛主要是由多不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）氧化降解產生，其風味對魚肉的腥味有較大貢獻[15,21]；此外，壬醛、2-辛烯醛、2,4-癸二烯醛也被證實是造成水產品產生魚腥味的物質[6,14,22]。OAV可用于表示每種揮發性物質對樣品的貢獻程度，當OAV＜1時，表明嗅覺器官對該物質無感覺，該物質對樣品總體氣味無顯著作用；當OAV≥1時，說明該物質可能對樣品總體氣味有直接影響；且在一定范圍內，OAV越大說明該物質對樣品總體氣味的貢獻越大[23]。通過OAV分析可知，對白鰱揮發性氣味貢獻較大（OAV≥1）的醛類主要有己醛、壬醛、辛醛、庚醛、癸醛、2,4-癸二烯醛、2-辛烯醛，其中辛醛的OAV最高，達到316.81，由氣味描述可知辛醛為油脂味、青草味，對白鰱魚肉的整體風味起主要作用。

由表3可知，魚肉加入熱水洗YG后，醛類化合物約占24.98%，其中己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、2-辛烯醛、2,4-癸二烯醛的含量均有不同程度的減少，且酵母葡聚糖添加前后己醛、庚醛和壬醛的含量差異顯著（P＜0.05）。由氣味描述可知這3 種物質主要味道為青草味和魚腥味，這也是感官評價中白鰱魚肉加入酵母葡聚糖后青草味和魚腥味明顯降低的原因。通過內標法定量計算，對魚腥味貢獻較大的己醛、壬醛含量從486.94、318.59 μg/kg降至375.49、240.53 μg/kg，下降率分別為22.9%和24.5%，這是由于酵母葡聚糖對魚肉中的揮發性成分有吸附作用，從而降低魚肉中腥味物質含量以降低腥味。實驗室在前期研究酵母葡聚糖對魚肉中土腥味物質的影響時也發現了酵母葡聚糖能夠對土霉味物質吸附結合，影響土霉味物質的釋放[11]。

2.4.2 醇類化合物

在新鮮魚肉中共檢測出3 種醇類物質，分別為1-辛烯-3-醇、庚醇和壬醇，其中1-辛烯-3-醇含量最高。醇類物質是脂肪在脂肪氧化酶的作用下發生氧化而產生的[24]。一般認為，不飽和醇類化合物的閾值都相對較低，對魚肉氣味的貢獻相對較大，而飽和醇類化合物的閾值較高，對魚肉的揮發性氣味貢獻較小[11,25]。由表3可知，不飽和醇類物質1-辛烯-3-醇的OAV為122.54，對魚肉的氣味貢獻較大，它被廣泛地報道為生蘑菇的氣味，是飽和脂肪酸在酶的作用下催化氧化產生[15]。另外，在新鮮魚肉中也檢測到的庚醇具有堅果味和淡芳香氣味，其OAV為10.49，因此也是白鰱魚肉的特征揮發性成分之一[11]。此外，檢測到的呈油脂味的壬醇對魚肉的風味起一定的修飾作用，貢獻不大。

加入酵母葡聚糖后，魚肉-酵母葡聚糖復合物中僅檢測出1-辛烯-3-醇和庚醇2 種醇類化合物，呈現油脂味的壬醇未檢出。由內標法計算可知對魚腥味貢獻較大的1-辛烯-3-醇含量與新鮮魚肉相比存在顯著差異，由原來的183.81 μg/kg下降至128.86 μg/kg，減少了30.0%，同樣說明經酵母葡聚糖可在一定程度上吸附去除白鰱魚肉的腥味物質。

2.4.3 酮類化合物

酮類物質由于其閾值相對較高，因此對魚肉整體的氣味貢獻相對較小[26]。如表3所示，在新鮮魚肉中共檢測出3,5-辛二烯酮、2,5-辛二酮2 種酮類物質，種類少且含量較低，對魚肉的總體氣味貢獻較小（OAV＜1）。添加酵母葡聚糖后3,5-辛二烯酮的含量減少，2,5-辛二酮的含量有所增加。

2.4.4 烴類化合物

在新鮮魚肉中共檢測到7 種烴類物質，其中烷烴類5 種，烯烴類2 種，而烷烴類化合物含量較高。這些化合物可能是類胡蘿卜素的分解或烷基自由基的脂質氧化過程生成的產物[25]。有研究認為，烴類化合物在形成對肉的風味有較大貢獻的雜環化合物的過程中，起到了重要作用，對形成肉的整體風味具有不可忽視的作用，而烯烴類化合物在一定條件下可轉化為醛類和酮類物質，因此烴類物質也是能形成魚特征風味的一種潛在物質[11,27]。由表3可知，在新鮮魚肉中檢測出的十七烷和8-十七烷烯的含量相對較高，這與其他報道一致[22,28]。當魚肉中加入前處理過的酵母葡聚糖后，十四烷、十七烷、8-十七烷烯含量略有增加，其他烷烴含量均有所降低。

表3 酵母葡聚糖處理對白鰱魚肉中揮發性成分的影響Table 3Effect of addition of hot water-washed yeast glucan on volatile components in silver carp meat

2.5 前處理酵母葡聚糖對白鰱魚肉TBARS值的影響

圖4 溫度對酵母葡聚糖處理白鰱魚肉TBARS值的影響Fig.4 TBARS values in silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan after 2 h storage at different temperatures

TBARS值代表脂肪氧化的程度，脂肪氧化后產生的醛酮類物質會造成魚肉產生腥味，因此TBARS值與腥味密切相關[21]。當TBARS值大于2.0 mg/kg時，魚肉會產生明顯的腥味[30]。由圖4可知，隨著溫度的升高，白鰱魚肉（空白對照組）的TBARS值升高。與空白對照組相比，在0 ℃時，加入熱水洗YG的魚肉TBARS值最低，僅為0.20 mg/kg，遠低于空白對照組的0.31 mg/kg。在0～40 ℃處理溫度下，魚肉-酵母葡聚糖復合物和魚肉-BHT復合物（陽性對照組）的TBARS值顯著低于空白對照組，且魚肉-酵母葡聚糖復合物TBARS值低于陽性對照組。陽性對照組中的抗氧化劑BHT可通過清除自由基抑制脂肪氧化，因而常被應用在食品中減小因脂肪氧化而產生的異味[12]。由此可知，酵母葡聚糖具有與BHT相當的功能，也可以抑制脂肪氧化從而減小魚肉中的腥味。有研究表明，β-葡聚糖具有抗氧化能力，可螯合金屬離子，清除超氧化物，還可以作為氫質子的供體，穩定自由基，從而抑制脂肪氧化[31-32]。當溫度升至60 ℃時，陽性對照組的TBARS值較小，而魚肉-酵母葡聚糖復合物與空白對照組相比，TBARS值沒有明顯差異。這是由于在較高溫度時，脂肪氧化速率會急劇增大，酵母葡聚糖在抑制脂肪氧化的能力上則劣于傳統小分子抗氧化劑BHT。

3 結 論

酵母葡聚糖自帶酵母風味，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜檢測到其中含有30 種揮發性成分，通過熱水洗法處理過的酵母葡聚糖僅含9 種，且對風味貢獻較大的2-壬烯醛和辛醛含量降低明顯。將熱水洗YG添加至魚肉中，魚肉的魚腥味和青草味顯著降低，土霉味也有所減弱，與新鮮魚肉風味具有顯著差異。通過氣相色譜-質譜分析新鮮魚肉共有23 種揮發性成分，其中己醛、壬醛、辛醛、2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇是魚特征風味的主要貢獻者。將熱水洗YG添加至魚肉中后，以上5 種物質含量均有不同程度的減小，且通過內標法計算己醛、壬醛和1-辛烯-3-醇的含量分別減小了22.9%、24.5%和30.0%，表明酵母葡聚糖可與風味物質吸附結合從而減小白鰱特征氣味。此外，酵母葡聚糖在較低溫度（≤37 ℃）時可降低魚肉的TBARS值，證明其還能抑制魚肉的脂肪氧化，從而減小其腥味物質的產生。