不同益生元對酸奶游離氨基酸及風(fēng)味的影響

李 蕊，王一然，劉一鳴，史海粟，陳 旭，趙瑛博，武俊瑞

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

酸奶因含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、核黃素、VB6和VB12，被認(rèn)為比牛奶具有更多的營養(yǎng)價值[1]。隨著人們生活水平及健康意識的提高，益生菌及益生元逐漸被用于酸奶發(fā)酵。益生菌使酸奶具有特殊的風(fēng)味，提高營養(yǎng)價值，同時具有控制血清膽固醇水平[2]、提高免疫力和預(yù)防癌癥[3]的作用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物乳桿菌[4]、瑞士乳桿菌[5]、副干酪乳桿菌[6]、干酪乳桿菌[7]等新型益生菌也逐漸被研發(fā)。

益生元是一種膳食補(bǔ)充劑，包括菊粉、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖等，與酸奶中添加的蔗糖不同，益生元可以改善宿主的健康[8]，促進(jìn)腸道有益菌生長[9]，利于營養(yǎng)素的消化吸收[10]，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，預(yù)防肥胖和便秘[11]，降低腸道pH值，減少心血管疾病及癌癥風(fēng)險[12]，還可以增加鈣和鎂的吸收[13]，影響血糖水平并改善血漿脂質(zhì)[14]。益生元對有益菌有增殖效果，菊粉能增加雙歧桿菌的代謝活性[15]；低聚木糖和低聚異麥芽糖可以影響酸奶中乳酸菌的數(shù)量[16]。同時，益生元的添加對酸奶的品質(zhì)、結(jié)構(gòu)也存在一定的影響，菊粉可以使酸奶的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，增強(qiáng)酸奶的固體性質(zhì)[17]，且不會對酸奶本身產(chǎn)生影響[18]。β-葡聚糖會減弱酸奶的凝膠程度，進(jìn)而提高酸奶中益生菌的活力[19]。但益生元對酸奶風(fēng)味的影響參差不一，菊粉具有類似蔗糖的甜味，可以提高產(chǎn)品的甜味[20]，而低聚果糖、低聚半乳糖等益生元會減弱酸奶的風(fēng)味[21]。聚葡萄糖的添加會使酸奶產(chǎn)生不良風(fēng)味，降低酸奶的接受度[22]，低聚異麥芽糖[23]、菊苣粉[24]會降低酸奶的口感。

益生元在酸奶中發(fā)揮有益作用，使其具有更廣泛的研究空間與開發(fā)前景。目前，對于益生元酸奶的研究主要集中于理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)質(zhì)地、益生菌及發(fā)酵菌種的影響，對酸奶游離氨基酸及風(fēng)味的研究較少。不同益生元間分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)間存在差異，進(jìn)而會對酸奶中游離氨基酸及風(fēng)味產(chǎn)生不同影響。本實(shí)驗(yàn)以添加不同益生元發(fā)酵的酸奶為研究對象，除檢測蛋白質(zhì)、脂肪等基本營養(yǎng)成分外，對不同種益生元發(fā)酵酸奶的游離氨基酸種類及含量進(jìn)行檢測，同時對酸奶中游離氨基酸與整體風(fēng)味間的聯(lián)系進(jìn)行分析，旨在揭示添加不同益生元對工業(yè)化發(fā)酵酸奶中游離氨基酸和風(fēng)味的影響，為益生菌酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳為市售純牛奶。

嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌 法國Danisco公司；低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、蔗糖山東龍力生物科技股份有限公司；電子舌內(nèi)部溶液、參比溶液、陰、陽離子溶液 日本Insent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

120 乳品綜合成分指標(biāo)分析儀 美國Flowserve公司；5424R高速臺式離心機(jī) 德國艾本德股份公司；SA402B電子舌 日本Insent公司；L-8900高效氨基酸分析儀日本日立公司；超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 添加不同益生元酸奶樣品的制備

以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌1∶1混合作為發(fā)酵劑，以添加5%蔗糖、42 ℃發(fā)酵的酸奶為對照組，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，同等條件下酸奶制備重復(fù)3 次，制備過程如下：

1.3.2 酸奶中基本營養(yǎng)成分含量測定

采用120乳品綜合成分指標(biāo)分析儀進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.3 電子舌味感的測定

利用電化學(xué)傳感器，通過測定液體樣本的綜合味覺信息，對被測試樣進(jìn)行定量和定性分析。實(shí)驗(yàn)取適量體積酸奶進(jìn)行測定，包括酸、苦、澀、咸、鮮及味感的豐富度。

1.3.4 添加不同益生元酸奶中游離氨基酸含量的測定

1.3.4.1 酸奶樣品的前處理

根據(jù)Mayer等[25]的方法稍作修改，取待測酸奶樣品加入5%磺基水楊酸混勻，離心后靜置過膜，裝入上樣瓶備用。

1.3.4.2 色譜條件

分析柱（4.6 mm×60 mm，3 μm），柱溫57.0 ℃，反應(yīng)柱溫度135 ℃，泵1流速0.45 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。紫外檢測器：脯氨酸在波長440 nm處測定吸光度，其他氨基酸在波長570 nm處測定吸光度。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4.3 游離氨基酸含量的計算

式中：Ci為游離氨基酸質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為樣品體積/mL；F為稀釋倍數(shù)；M為氨基酸摩爾質(zhì)量/（g/mol）；m為酸奶質(zhì)量/mg。

1.3.5 營養(yǎng)評價

根據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organation，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organation，WHO）最佳配比模式進(jìn)行營養(yǎng)評價，即氨基酸評分（amino acid score，AAS），按式（2）計算：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用單因素及相關(guān)性分析進(jìn)行顯著性分析；作圖采用軟件Origin 8.6和Sigma Plot 11。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生元發(fā)酵酸奶中基本營養(yǎng)成分

添加不同益生元發(fā)酵酸奶，當(dāng)酸度達(dá)到70 °T時，停止發(fā)酵，相較于對照組發(fā)酵時間4.5 h，添加益生元組發(fā)酵時間有所差異，其中低聚木糖組發(fā)酵時間為4 h，低聚半乳糖組為5.2 h，低聚異麥芽糖組為6 h。利用乳品綜合成分指標(biāo)分析儀對不同益生元發(fā)酵酸奶的基本營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，包括脂肪、蛋白質(zhì)、總固形物、非脂乳固體含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同益生元發(fā)酵酸奶中基本營養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of basic nutrients in yoghurts added with different probiotics%

發(fā)酵時間反映了不同益生元對酸奶中產(chǎn)酸菌株的作用存在差異，說明不同益生素的添加會影響酸奶中產(chǎn)酸菌株的活力，即低聚木糖可以提高保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的活力，但低聚異麥芽糖及低聚半乳糖作用不明顯，為益生元在酸奶工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

由表1可知，低聚異麥芽糖酸奶中總固形物和非脂乳固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為16.02%、9.22%，低聚木糖酸奶中脂肪和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為3.54%、3.11%。GB 19302—2010《發(fā)酵乳》規(guī)定蛋白質(zhì)≥2.9%，脂肪≥3.1%，非脂乳固體≥8.1%，可以看出，添加不同益生元發(fā)酵酸奶的蛋白質(zhì)含量、脂肪含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。益生元的添加可以提高酸奶中營養(yǎng)物質(zhì)含量，使酸奶的品質(zhì)得到提升，且添加低聚木糖發(fā)酵的酸奶營養(yǎng)品質(zhì)最好。

2.2 不同益生元發(fā)酵酸奶的電子舌味感分析

圖1 不同益生元發(fā)酵酸奶電子舌雷達(dá)圖Fig.1 Electronic tongue radar chart of yogurts added with different probiotics

從圖1可以看出，添加不同益生元對酸奶的酸味有顯著影響，從其酸味大小依次為：低聚木糖＜低聚半乳糖＜低聚異麥芽糖＜對照組。添加低聚異麥芽糖的酸奶澀味值顯著小于其他組（P＜0.05），添加低聚異麥芽糖和低聚木糖的酸奶鮮味值顯著大于對照組（P＜0.05），添加低聚異麥芽糖的酸奶甜味值顯著大于對照組（P＜0.05），添加低聚木糖酸奶的苦味值顯著大于其他組（P＜0.05）。綜合得出，添加益生元可以降低酸奶的甜味，添加低聚異麥芽糖酸奶的口感要稍高于其他組別的酸奶。

2.3 不同益生元發(fā)酵酸奶中游離氨基酸含量

表2 添加不同益生元酸奶中游離氨基酸含量Table 2 Contents of free amino acids in yogurts added with different probiotics mg/g

由表2可知，從酸奶中共檢測出17 種游離氨基酸，其中含8 種必需氨基酸。從整體看，添加低聚木糖酸奶中必需氨基酸含量最多，依次為低聚木糖＞對照組＞低聚異麥芽糖＞低聚半乳糖，且總氨基酸含量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組及對照組（P＜0.05）。添加低聚異麥芽糖組和對照組中總氨基酸含量顯著高于低聚半乳糖組（P＜0.05）。

此外，添加低聚木糖酸奶的Ser、Glu、Arg含量顯著高于添加低聚半乳糖組（P＜0.05）；其中Thr、Val、Ile、Phe、Leu、Tyr等11 種氨基酸含量均高于對照組，且Leu、Tyr含量顯著高于對照組（P＜0.05），Leu有助于調(diào)節(jié)血糖水平[26]，促進(jìn)動物生長[27]；Tyr可被代謝成延胡索酸，參與三羧酸循環(huán)，為機(jī)體提供能量。此外，低聚木糖酸奶中Val、Ile和Leu含量均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），當(dāng)Val、Ile和Leu協(xié)同作用時，具有修復(fù)肌肉、控制血糖、提供能量的作用。

2.4 不同益生元發(fā)酵酸奶主成分分析

圖2 添加不同益生元發(fā)酵酸奶的主成分分析得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 PCA score plot (A) and loading plot (B) of yogurts added with different probiotics

由圖2A可以看出，不同添加物發(fā)酵酸奶分布在不同區(qū)域，主成分存在較大差異，且4 組樣品數(shù)據(jù)均分布在95%的置信區(qū)間內(nèi)，說明添加不同益生元發(fā)酵酸奶與蔗糖發(fā)酵酸奶的游離氨基酸組分及含量存在很大差異，區(qū)分較為明顯。可以看出，組間分離較為清楚，組內(nèi)聚集性良好，分布結(jié)果比較理想，且相較于對照組，添加益生元實(shí)驗(yàn)組分布更為集中、均勻，說明樣品重復(fù)性好，游離氨基酸含量較為穩(wěn)定，進(jìn)一步說明了添加益生元發(fā)酵酸奶均一性、穩(wěn)定性良好，營養(yǎng)品質(zhì)更為穩(wěn)定。

由圖2B可知，添加低聚木糖組Val、Ile、Leu等游離氨基酸含量較高，所以分布在PC1負(fù)方向。添加低聚異麥芽糖組和對照組His、Pro、Ala、Val、Asp、Ser等游離氨基酸含量較高，所以分布在PC2正方向。而添加低聚半乳糖組游離氨基酸含量相較于其他組略低，所以PC1正方向與PC2負(fù)方向重疊區(qū)域無氨基酸出現(xiàn)。可以體現(xiàn)出，正是不同游離氨基酸含量及配比導(dǎo)致了添加不同益生元發(fā)酵酸奶樣品之間的差異。

2.5 呈味特征分析

氨基酸可分為鮮味、甜味、苦味和無味，鮮味氨基酸有Asp和Glu；甜味氨基酸有Thr、Ser、Gly和Ala[28]；苦味氨基酸有His、Phe、Ile、Leu、Tyr、Val、Met和Arg；無味氨基酸有Cys、Lys和Pro。添加不同益生元發(fā)酵酸奶的呈味氨基酸含量如圖3所示。

圖3 添加不同益生元發(fā)酵酸奶呈味氨基酸含量Fig.3 Contents of taste amino acids in yogurts with different probiotics added

由圖3可知，各組間呈味氨基酸含量存在顯著差異，其中，添加低聚木糖組鮮味、甜味、苦味氨基酸均顯著高于其他組（P＜0.05），且鮮味與苦味的含量與其他組差異較為明顯，印證了圖1中添加低聚木糖組鮮味苦味均大于其他組的結(jié)果；而圖3所顯示甜味氨基酸含量的結(jié)果與圖1結(jié)果有所差異，分析原因在于甜味氨基酸含量在總氨基酸含量中所占比重較小，導(dǎo)致作用效果不夠明顯。添加低聚異麥芽糖組鮮味顯著高于對照組（P＜0.05）。添加低聚半乳糖組各呈味氨基酸均小于其他實(shí)驗(yàn)組及對照組。

2.6 滋味活性值（taste active value，TAV）分析

各種游離氨基酸體現(xiàn)出不同的呈味特征，是由于呈味物質(zhì)含量及其味道閾值有所不同。TAV是各呈味物質(zhì)在樣品中的含量與其對應(yīng)的味道閾值之比。通常認(rèn)為，當(dāng)TAV大于1時，該物質(zhì)對樣品的滋味有影響[29]。根據(jù)表2添加不同益生元發(fā)酵酸奶中各游離氨基酸含量及表3味道閾值，分析得到各游離氨基酸在添加不同益生元組分中的TAV，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，添加低聚異麥芽糖組有15 種氨基酸TAV大于1，添加低聚木糖組次之，有14 種，添加低聚半乳糖組與對照組最少，有13 種。添加低聚木糖組中，對其味道有特別貢獻(xiàn)的為Val、Ile和Phe，均為苦味氨基酸，其TAV分別為20.20、9.36和7.41。均高于其他品種，進(jìn)一步印證了圖1添加低聚木糖組鮮味苦味均大于其他組的結(jié)果。對照組中，對其味道有特別貢獻(xiàn)的為His、Ala，分別為苦味氨基酸和甜味氨基酸。總體來看，各實(shí)驗(yàn)組Val、Phe、Ile、Arg和His對苦味貢獻(xiàn)較大，Glu對鮮味貢獻(xiàn)較大，Ala對甜味貢獻(xiàn)較大。Met和Tyr對風(fēng)味整體沒有貢獻(xiàn)，其余各氨基酸對酸奶風(fēng)味影響大小依次為：Glu＞His＞Val＞Lys＞Ala＞Arg＞Ile＞Phe＞Pro＞Ser＞Leu＞Gly＞Asp＞Thr＞Cys。

表3 不同益生元發(fā)酵酸奶游離氨基酸TAVTable 3 TAV of free amino acids in yogurts added with different probiotics

表4 添加不同益生元發(fā)酵酸奶游離氨基酸與味感相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between free amino acids and taste characteristics of yoghurts added with different probiotics

2.7 不同營養(yǎng)素發(fā)酵酸奶相關(guān)性分析

由表4可知，Ile、Val、Leu、Phe均為苦味氨基酸，Ile、Val呈顯著正相關(guān)，Leu和Ile呈極顯著正相關(guān)，苦味與Phe呈極顯著正相關(guān)；Glu、Asp為鮮味氨基酸，Ser、Thr為甜味氨基酸，Glu與Ser呈顯著正相關(guān)，鮮味與Thr呈顯著正相關(guān)，甜味與Asp呈極顯著正相關(guān)，這3 組關(guān)系相互印證了鮮味氨基酸與甜味氨基酸顯著相關(guān)。Tyr為苦味氨基酸，酸味與Tyr呈顯著負(fù)相關(guān)，這與圖1中對照組酸味大、苦味小以及添加低聚木糖組苦味大、酸味小的結(jié)果吻合，同時驗(yàn)證了Tseng等[30]對氨基酸滋味的特征描述。

2.8 營養(yǎng)評價

表5 添加不同益生元發(fā)酵酸奶的AASTable 5 Amino acid scores of yoghurts with different probiotics added

FAO/WHO推薦的氨基酸模式中人體的各AAS分別為Ile 4.0、Leu 7.0、Lys 5.5、Met＋Cys 3.5、Phe＋Tyr 6.0、Thr 4.0、Val 5.0，由表5可知，Ile、Lys、Phe＋Tyr、Thr、Val的AAS均高于模式譜標(biāo)準(zhǔn)值，且添加低聚木糖組最高。添加低聚木糖組和對照組Leu的AAS高于模式譜標(biāo)準(zhǔn)值，Met＋Cys的各實(shí)驗(yàn)組均未達(dá)到氨基酸模式譜標(biāo)準(zhǔn)值。越接近氨基酸模式，即營養(yǎng)價值越均衡，因此，可以看出實(shí)驗(yàn)樣品營養(yǎng)價值不夠均衡，但作為人體主要限制氨基酸之一的賴氨酸評分值較高，且添加低聚木糖組最高。

3 結(jié) 論

添加不同益生元對酸奶中發(fā)酵菌株、氨基酸含量及風(fēng)味存在不同程度的影響。其中，各實(shí)驗(yàn)組的基本營養(yǎng)成分均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，低聚木糖可以提高保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌活力；不同組分電子舌味感結(jié)果有所不同，對酸味影響最大；低聚木糖的添加可以提高Leu、Tyr、Ile、Val、Ser、Glu和Arg的含量；各實(shí)驗(yàn)組主成分間存在較大差異；結(jié)合相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鮮味、甜味氨基酸呈顯著正相關(guān)；添加低聚木糖組的AAS最高，且作為人體主要限制氨基酸之一的Lys評分值最高。因此，添加低聚木糖發(fā)酵的酸奶風(fēng)味更好，營養(yǎng)價值更高，具有更好的益生作用。為其后續(xù)的風(fēng)味研究及產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)利用了提供理論依據(jù)。