不同益生元對酸奶游離氨基酸及風味的影響

李 蕊，王一然，劉一鳴，史海粟，陳 旭，趙瑛博，武俊瑞

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

酸奶因含有豐富的蛋白質、鈣、核黃素、VB6和VB12，被認為比牛奶具有更多的營養價值[1]。隨著人們生活水平及健康意識的提高，益生菌及益生元逐漸被用于酸奶發酵。益生菌使酸奶具有特殊的風味，提高營養價值，同時具有控制血清膽固醇水平[2]、提高免疫力和預防癌癥[3]的作用。隨著科學技術的發展，植物乳桿菌[4]、瑞士乳桿菌[5]、副干酪乳桿菌[6]、干酪乳桿菌[7]等新型益生菌也逐漸被研發。

益生元是一種膳食補充劑，包括菊粉、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖等，與酸奶中添加的蔗糖不同，益生元可以改善宿主的健康[8]，促進腸道有益菌生長[9]，利于營養素的消化吸收[10]，增強免疫系統，預防肥胖和便秘[11]，降低腸道pH值，減少心血管疾病及癌癥風險[12]，還可以增加鈣和鎂的吸收[13]，影響血糖水平并改善血漿脂質[14]。益生元對有益菌有增殖效果，菊粉能增加雙歧桿菌的代謝活性[15]；低聚木糖和低聚異麥芽糖可以影響酸奶中乳酸菌的數量[16]。同時，益生元的添加對酸奶的品質、結構也存在一定的影響，菊粉可以使酸奶的結構更加穩定，增強酸奶的固體性質[17]，且不會對酸奶本身產生影響[18]。β-葡聚糖會減弱酸奶的凝膠程度，進而提高酸奶中益生菌的活力[19]。但益生元對酸奶風味的影響參差不一，菊粉具有類似蔗糖的甜味，可以提高產品的甜味[20]，而低聚果糖、低聚半乳糖等益生元會減弱酸奶的風味[21]。聚葡萄糖的添加會使酸奶產生不良風味，降低酸奶的接受度[22]，低聚異麥芽糖[23]、菊苣粉[24]會降低酸奶的口感。

益生元在酸奶中發揮有益作用，使其具有更廣泛的研究空間與開發前景。目前，對于益生元酸奶的研究主要集中于理化性質、結構質地、益生菌及發酵菌種的影響，對酸奶游離氨基酸及風味的研究較少。不同益生元間分子質量、結構間存在差異，進而會對酸奶中游離氨基酸及風味產生不同影響。本實驗以添加不同益生元發酵的酸奶為研究對象，除檢測蛋白質、脂肪等基本營養成分外，對不同種益生元發酵酸奶的游離氨基酸種類及含量進行檢測，同時對酸奶中游離氨基酸與整體風味間的聯系進行分析，旨在揭示添加不同益生元對工業化發酵酸奶中游離氨基酸和風味的影響，為益生菌酸奶的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳為市售純牛奶。

嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌 法國Danisco公司；低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、蔗糖山東龍力生物科技股份有限公司；電子舌內部溶液、參比溶液、陰、陽離子溶液 日本Insent公司。

1.2 儀器與設備

120 乳品綜合成分指標分析儀 美國Flowserve公司；5424R高速臺式離心機 德國艾本德股份公司；SA402B電子舌 日本Insent公司；L-8900高效氨基酸分析儀日本日立公司；超高效液相色譜-串聯飛行時間質譜系統美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 添加不同益生元酸奶樣品的制備

以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌1∶1混合作為發酵劑，以添加5%蔗糖、42 ℃發酵的酸奶為對照組，為保證實驗結果的可靠性，同等條件下酸奶制備重復3 次，制備過程如下：

1.3.2 酸奶中基本營養成分含量測定

采用120乳品綜合成分指標分析儀進行測定，實驗均重復3 次。

1.3.3 電子舌味感的測定

利用電化學傳感器，通過測定液體樣本的綜合味覺信息，對被測試樣進行定量和定性分析。實驗取適量體積酸奶進行測定，包括酸、苦、澀、咸、鮮及味感的豐富度。

1.3.4 添加不同益生元酸奶中游離氨基酸含量的測定

1.3.4.1 酸奶樣品的前處理

根據Mayer等[25]的方法稍作修改，取待測酸奶樣品加入5%磺基水楊酸混勻，離心后靜置過膜，裝入上樣瓶備用。

1.3.4.2 色譜條件

分析柱（4.6 mm×60 mm，3 μm），柱溫57.0 ℃，反應柱溫度135 ℃，泵1流速0.45 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，進樣量20 μL。紫外檢測器：脯氨酸在波長440 nm處測定吸光度，其他氨基酸在波長570 nm處測定吸光度。為保證實驗結果可靠性，實驗重復3 次。

1.3.4.3 游離氨基酸含量的計算

式中：Ci為游離氨基酸質量濃度/（ng/mL）；V為樣品體積/mL；F為稀釋倍數；M為氨基酸摩爾質量/（g/mol）；m為酸奶質量/mg。

1.3.5 營養評價

根據聯合國糧食與農業組織（Food and Agriculture Organation，FAO）/世界衛生組織（World Health Organation，WHO）最佳配比模式進行營養評價，即氨基酸評分（amino acid score，AAS），按式（2）計算：

1.4 數據統計分析

采用SPSS 22.0進行數據統計，采用單因素及相關性分析進行顯著性分析；作圖采用軟件Origin 8.6和Sigma Plot 11。

2 結果與分析

2.1 不同益生元發酵酸奶中基本營養成分

添加不同益生元發酵酸奶，當酸度達到70 °T時，停止發酵，相較于對照組發酵時間4.5 h，添加益生元組發酵時間有所差異，其中低聚木糖組發酵時間為4 h，低聚半乳糖組為5.2 h，低聚異麥芽糖組為6 h。利用乳品綜合成分指標分析儀對不同益生元發酵酸奶的基本營養成分進行測定，包括脂肪、蛋白質、總固形物、非脂乳固體含量，結果如表1所示。

表1 不同益生元發酵酸奶中基本營養成分質量分數Table 1 Contents of basic nutrients in yoghurts added with different probiotics%

發酵時間反映了不同益生元對酸奶中產酸菌株的作用存在差異，說明不同益生素的添加會影響酸奶中產酸菌株的活力，即低聚木糖可以提高保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的活力，但低聚異麥芽糖及低聚半乳糖作用不明顯，為益生元在酸奶工業化生產中的應用提供參考。

由表1可知，低聚異麥芽糖酸奶中總固形物和非脂乳固體質量分數最高，分別為16.02%、9.22%，低聚木糖酸奶中脂肪和蛋白質質量分數最高，分別為3.54%、3.11%。GB 19302—2010《發酵乳》規定蛋白質≥2.9%，脂肪≥3.1%，非脂乳固體≥8.1%，可以看出，添加不同益生元發酵酸奶的蛋白質含量、脂肪含量均符合國家標準。益生元的添加可以提高酸奶中營養物質含量，使酸奶的品質得到提升，且添加低聚木糖發酵的酸奶營養品質最好。

2.2 不同益生元發酵酸奶的電子舌味感分析

圖1 不同益生元發酵酸奶電子舌雷達圖Fig.1 Electronic tongue radar chart of yogurts added with different probiotics

從圖1可以看出，添加不同益生元對酸奶的酸味有顯著影響，從其酸味大小依次為：低聚木糖＜低聚半乳糖＜低聚異麥芽糖＜對照組。添加低聚異麥芽糖的酸奶澀味值顯著小于其他組（P＜0.05），添加低聚異麥芽糖和低聚木糖的酸奶鮮味值顯著大于對照組（P＜0.05），添加低聚異麥芽糖的酸奶甜味值顯著大于對照組（P＜0.05），添加低聚木糖酸奶的苦味值顯著大于其他組（P＜0.05）。綜合得出，添加益生元可以降低酸奶的甜味，添加低聚異麥芽糖酸奶的口感要稍高于其他組別的酸奶。

2.3 不同益生元發酵酸奶中游離氨基酸含量

表2 添加不同益生元酸奶中游離氨基酸含量Table 2 Contents of free amino acids in yogurts added with different probiotics mg/g

由表2可知，從酸奶中共檢測出17 種游離氨基酸，其中含8 種必需氨基酸。從整體看，添加低聚木糖酸奶中必需氨基酸含量最多，依次為低聚木糖＞對照組＞低聚異麥芽糖＞低聚半乳糖，且總氨基酸含量顯著高于其他實驗組及對照組（P＜0.05）。添加低聚異麥芽糖組和對照組中總氨基酸含量顯著高于低聚半乳糖組（P＜0.05）。

此外，添加低聚木糖酸奶的Ser、Glu、Arg含量顯著高于添加低聚半乳糖組（P＜0.05）；其中Thr、Val、Ile、Phe、Leu、Tyr等11 種氨基酸含量均高于對照組，且Leu、Tyr含量顯著高于對照組（P＜0.05），Leu有助于調節血糖水平[26]，促進動物生長[27]；Tyr可被代謝成延胡索酸，參與三羧酸循環，為機體提供能量。此外，低聚木糖酸奶中Val、Ile和Leu含量均顯著高于其他實驗組（P＜0.05），當Val、Ile和Leu協同作用時，具有修復肌肉、控制血糖、提供能量的作用。

2.4 不同益生元發酵酸奶主成分分析

圖2 添加不同益生元發酵酸奶的主成分分析得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 PCA score plot (A) and loading plot (B) of yogurts added with different probiotics

由圖2A可以看出，不同添加物發酵酸奶分布在不同區域，主成分存在較大差異，且4 組樣品數據均分布在95%的置信區間內，說明添加不同益生元發酵酸奶與蔗糖發酵酸奶的游離氨基酸組分及含量存在很大差異，區分較為明顯。可以看出，組間分離較為清楚，組內聚集性良好，分布結果比較理想，且相較于對照組，添加益生元實驗組分布更為集中、均勻，說明樣品重復性好，游離氨基酸含量較為穩定，進一步說明了添加益生元發酵酸奶均一性、穩定性良好，營養品質更為穩定。

由圖2B可知，添加低聚木糖組Val、Ile、Leu等游離氨基酸含量較高，所以分布在PC1負方向。添加低聚異麥芽糖組和對照組His、Pro、Ala、Val、Asp、Ser等游離氨基酸含量較高，所以分布在PC2正方向。而添加低聚半乳糖組游離氨基酸含量相較于其他組略低，所以PC1正方向與PC2負方向重疊區域無氨基酸出現?？梢泽w現出，正是不同游離氨基酸含量及配比導致了添加不同益生元發酵酸奶樣品之間的差異。

2.5 呈味特征分析

氨基酸可分為鮮味、甜味、苦味和無味，鮮味氨基酸有Asp和Glu；甜味氨基酸有Thr、Ser、Gly和Ala[28]；苦味氨基酸有His、Phe、Ile、Leu、Tyr、Val、Met和Arg；無味氨基酸有Cys、Lys和Pro。添加不同益生元發酵酸奶的呈味氨基酸含量如圖3所示。

圖3 添加不同益生元發酵酸奶呈味氨基酸含量Fig.3 Contents of taste amino acids in yogurts with different probiotics added

由圖3可知，各組間呈味氨基酸含量存在顯著差異，其中，添加低聚木糖組鮮味、甜味、苦味氨基酸均顯著高于其他組（P＜0.05），且鮮味與苦味的含量與其他組差異較為明顯，印證了圖1中添加低聚木糖組鮮味苦味均大于其他組的結果；而圖3所顯示甜味氨基酸含量的結果與圖1結果有所差異，分析原因在于甜味氨基酸含量在總氨基酸含量中所占比重較小，導致作用效果不夠明顯。添加低聚異麥芽糖組鮮味顯著高于對照組（P＜0.05）。添加低聚半乳糖組各呈味氨基酸均小于其他實驗組及對照組。

2.6 滋味活性值（taste active value，TAV）分析

各種游離氨基酸體現出不同的呈味特征，是由于呈味物質含量及其味道閾值有所不同。TAV是各呈味物質在樣品中的含量與其對應的味道閾值之比。通常認為，當TAV大于1時，該物質對樣品的滋味有影響[29]。根據表2添加不同益生元發酵酸奶中各游離氨基酸含量及表3味道閾值，分析得到各游離氨基酸在添加不同益生元組分中的TAV，結果如表3所示。

由表3可知，添加低聚異麥芽糖組有15 種氨基酸TAV大于1，添加低聚木糖組次之，有14 種，添加低聚半乳糖組與對照組最少，有13 種。添加低聚木糖組中，對其味道有特別貢獻的為Val、Ile和Phe，均為苦味氨基酸，其TAV分別為20.20、9.36和7.41。均高于其他品種，進一步印證了圖1添加低聚木糖組鮮味苦味均大于其他組的結果。對照組中，對其味道有特別貢獻的為His、Ala，分別為苦味氨基酸和甜味氨基酸?？傮w來看，各實驗組Val、Phe、Ile、Arg和His對苦味貢獻較大，Glu對鮮味貢獻較大，Ala對甜味貢獻較大。Met和Tyr對風味整體沒有貢獻，其余各氨基酸對酸奶風味影響大小依次為：Glu＞His＞Val＞Lys＞Ala＞Arg＞Ile＞Phe＞Pro＞Ser＞Leu＞Gly＞Asp＞Thr＞Cys。

表3 不同益生元發酵酸奶游離氨基酸TAVTable 3 TAV of free amino acids in yogurts added with different probiotics

表4 添加不同益生元發酵酸奶游離氨基酸與味感相關性分析Table 4 Correlation analysis between free amino acids and taste characteristics of yoghurts added with different probiotics

2.7 不同營養素發酵酸奶相關性分析

由表4可知，Ile、Val、Leu、Phe均為苦味氨基酸，Ile、Val呈顯著正相關，Leu和Ile呈極顯著正相關，苦味與Phe呈極顯著正相關；Glu、Asp為鮮味氨基酸，Ser、Thr為甜味氨基酸，Glu與Ser呈顯著正相關，鮮味與Thr呈顯著正相關，甜味與Asp呈極顯著正相關，這3 組關系相互印證了鮮味氨基酸與甜味氨基酸顯著相關。Tyr為苦味氨基酸，酸味與Tyr呈顯著負相關，這與圖1中對照組酸味大、苦味小以及添加低聚木糖組苦味大、酸味小的結果吻合，同時驗證了Tseng等[30]對氨基酸滋味的特征描述。

2.8 營養評價

表5 添加不同益生元發酵酸奶的AASTable 5 Amino acid scores of yoghurts with different probiotics added

FAO/WHO推薦的氨基酸模式中人體的各AAS分別為Ile 4.0、Leu 7.0、Lys 5.5、Met＋Cys 3.5、Phe＋Tyr 6.0、Thr 4.0、Val 5.0，由表5可知，Ile、Lys、Phe＋Tyr、Thr、Val的AAS均高于模式譜標準值，且添加低聚木糖組最高。添加低聚木糖組和對照組Leu的AAS高于模式譜標準值，Met＋Cys的各實驗組均未達到氨基酸模式譜標準值。越接近氨基酸模式，即營養價值越均衡，因此，可以看出實驗樣品營養價值不夠均衡，但作為人體主要限制氨基酸之一的賴氨酸評分值較高，且添加低聚木糖組最高。

3 結 論

添加不同益生元對酸奶中發酵菌株、氨基酸含量及風味存在不同程度的影響。其中，各實驗組的基本營養成分均達到國家標準，低聚木糖可以提高保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌活力；不同組分電子舌味感結果有所不同，對酸味影響最大；低聚木糖的添加可以提高Leu、Tyr、Ile、Val、Ser、Glu和Arg的含量；各實驗組主成分間存在較大差異；結合相關性分析發現，鮮味、甜味氨基酸呈顯著正相關；添加低聚木糖組的AAS最高，且作為人體主要限制氨基酸之一的Lys評分值最高。因此，添加低聚木糖發酵的酸奶風味更好，營養價值更高，具有更好的益生作用。為其后續的風味研究及產品的開發生產利用了提供理論依據。