醬油釀造用耐鹽產乙醇風味酵母的選育及其應用

呂變梅，蔣雪薇,2,，彭 東，徐曉剛，丁 源，羅曉明,2，周尚庭

（1.長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114；2.湖南省調味品發酵工程技術研究中心，湖南 長沙 410600；3.加加食品集團股份有限公司，湖南 長沙 410600）

醬油是以大豆和小麥為主要原料，經過微生物及其酶系長期作用，最終形成具有特殊色澤和獨特醬香的傳統調味品[1]。醬油風味的形成是米曲霉、乳酸菌及酵母菌等多菌種相互作用的結果，其中酵母菌在發酵過程中產生的酯類、醇類等物質，對醬油風味的形成具有十分重要的貢獻[2]。目前應用于醬油發酵的酵母菌主要有魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、球擬酵母（Torulopsisspp.）和假絲酵母（Candidaspp.），其中魯氏接合酵母與球擬酵母應用最廣[3]。魯氏接合酵母是醬油釀造中后期風味形成的重要菌株之一，它在醬油發酵中可以提升乙醇、高級醇及芳香雜醇類物質的含量[4]。

醬油揮發性風味物質的研究中，乙醇作為一種常見的香氣成分被檢出，其特殊香味對醬油風味有重要影響，且能與酸類物質結合，生成各種風味物質及風味物質的前體，對醬油色澤風味的形成以及改善醬油品質發揮著重要的作用[5]。蔡金星等[6]研究發現，乙醇的存在對醬油的風味和色澤都有明顯影響，同時，一定量乙醇的存在有利于醬油保存[7]。日式醬油發酵研究發現，提高乙醇含量有利于提升醬油品質[8]。目前對于醬油中揮發性香氣成分乙醇的研究主要集中在檢測含量[9]及菌種添加引起的風味成分變化[10]，而改良耐鹽產乙醇菌種以獲得較好的乙醇產量并進行應用研究報道較少。本研究利用紫外誘變魯氏接合酵母L6選育得到1 株優良的耐鹽產乙醇酵母L6-1，研究其在高鹽稀態發酵中的應用，通過跟蹤分析發酵醬醪中乙醇積累量與揮發性風味物質的變化，確定添加產乙醇酵母對釀造醬油品質的提升作用，以期為耐鹽產乙醇風味酵母在醬油釀造中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

出發菌株：魯氏接合酵母L6，篩選自湖南某醬油廠的高鹽稀態醬醪中，由湖南省調味品發酵工程技術研究中心（長沙理工大學分中心）保藏。

1.1.2 培養基

豆芽汁培養基配制參照文獻[11]。

2,3 ,5 -氯化苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）篩選雙層培養基，上層培養基：葡萄糖5 g、瓊脂粉15 g、TTC試劑0.5 g，1 000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌15 min；下層培養基：葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、酵母膏1.5 g、MgSO4·7H2O 4 g、K2HPO41 g、瓊脂粉20 g，1 000 mL蒸餾水，調節pH 5.6～5.8，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

UV1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；ZWY-2102C恒溫振蕩培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；PE28型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YRE2000B旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；436GC/EVOQ TQ/PAL氣相色譜-質譜聯用儀美國布魯克科技有限公司；Rxi-5Sil MS色譜柱 瑞思泰康科技（北京）有限公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取針 美國色譜科公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外誘變致死率曲線的測定

將菌種接種至含質量分數10% NaCl的豆芽汁液體發酵培養基中，28 ℃、180 r/min培養24 h，取菌懸液，離心洗滌3 次后制成108個細胞/mL的菌懸液備用；吸取10 mL菌懸液于功率15 W紫外燈下，距離45 cm照射0、30、60、90、120、180、240 s后分別取樣稀釋涂平板，28 ℃避光培養48 h后計數，繪制致死率曲線[12]。致死率計算如式（1）所示：

1.3.2 突變株篩選

誘變后的菌懸液涂于TTC篩選平板的下層培養基，28 ℃恒溫培養48 h后，倒入TTC上層培養基，30 ℃避光保溫2～3 h。挑選TTC上層平板中顯色深的菌株，接入含10% NaCl的豆芽汁液體培養基中，28 ℃、180 r/min培養24 h，再在28 ℃恒溫培養箱中靜置培養48 h后，測定乙醇含量。

1.3.3 生長曲線的測定

將魯氏接合酵母L6與誘變后篩選的突變株L6-1分別接種于含10% NaCl的豆芽汁液體培養基中，28 ℃、180 r/min培養，在0～48 h每隔2 h取樣測OD570nm，繪制生長曲線。

1.3.4 高鹽稀態醬醪發酵工藝

按成品曲-鹽水1∶2（質量比）拌入質量分數23%的鹽水，制備16% NaCl的鹽鹵發酵醪，置于28 ℃保溫發酵，將出發菌株及選育菌株制備成濃度為107個細胞/mL的菌懸液，分別加入發酵25 d的醬醪中，接種量為5%（體積分數），28 ℃繼續恒溫發酵65 d，總發酵周期90 d，未添加酵母菌的為對照組。分別在發酵第0、15、30、45、60、75、90天取醬醪壓榨醬油，測定還原糖、總酸、氨態氮、乙醇含量。

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 乙醇含量測定

參照GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》的密度瓶法[13]。

1.3.5.2 發酵醬油理化指標測定

還原糖含量測定參照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[14]；總酸含量測定參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》[15]；氨態氮含量測定參照GB 18186—2000《釀造醬油》的甲醛法[16]。

1.3.5.3 高鹽稀態發酵醬油中揮發性風味物質分析

樣品準備：取成品醬油，添加5 μL質量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮作為內標物，總體積為2 mL[17]。固相微萃取條件：振蕩器50 ℃，將醬油樣品加熱振蕩25 min。氣相色譜條件：進樣口溫度250 ℃，程序升溫，40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣，流速1.2 mL/min，分流比10∶1。質譜條件：電子電離源，電子能量70 eV，發射電流200 μA，離子源溫度250 ℃，質量掃描范圍m/z30～500。揮發性化合物定量計算如式（2）所示：

式中：C1為揮發性化合物含量；C2為內標物含量；A1為揮發性化合物峰面積；A2為內標物峰面積。

1.4 數據處理

利用主成分分析對風味物質進行分析，使用SPSS軟件處理數據[18]，利用Origin 9.0進行數據可視化處理分析。

2 結果與分析

2.1 出發菌株的紫外誘變及乙醇高產菌株的篩選

魯氏接合酵母是耐高滲透壓酵母[19]，能在高鹽環境下生長，可利用原料降解產生的還原糖代謝產生乙醇[20]。前期從高鹽稀態發酵醬醪中篩選出1 株耐鹽魯氏接合酵母L6，其在含10% NaCl豆芽汁培養基中的乙醇積累量（體積分數）為1.75%，有一定的產乙醇能力，適合作為選育耐鹽產乙醇酵母的出發菌株。

紫外誘變是物理誘變中最為簡便安全的誘變劑，在選育中常作為誘變因子[21]。采用不同的照射時間處理制備好的菌懸液，繪制致死率曲線，結果見圖1。研究發現，正突變往往出現在致死率較低的情況下，選擇致死率70%～80%的誘變條件處理菌株，除能獲得較高的正突變率外，還比較易于篩選[22]，從圖1可以看出，致死率為70%～80%時，誘變處理時間為60～90 s，選擇誘變時間90 s，處理出發菌株L6，誘變后的菌懸涂布于TTC雙層平板，篩選獲得54 株生長良好、顯色明顯的突變菌株。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 Lethality of UV mutagenesis

圖2 耐鹽產乙醇突變株的篩選結果Fig.2 Results of screening for ethanol-producing mutants

TTC是一種無色顯色指示劑，能與酵母菌無氧呼吸代謝產生乙醇過程中被乙醇脫氫酶脫掉的氫結合，還原成紅色的1,3,5-三苯甲臜，因此通過呈色的深淺可以判斷出乙醇脫氫酶活力大小及產乙醇能力的高低，顏色越深，說明產乙醇能力越強[23]。TTC顯色篩選平板如圖2a（紅色圈標注出的為顯色深的菌落），對比54 個顯色明顯的菌株，選出顯色較深的15 株，豆芽汁發酵測定乙醇積累量，結果見圖2b。可以看出，突變株1、4、7、8、12乙醇積累量均高于出發菌株L6，將其分別命名為L6-1、L6-4、L6-7、L6-8和L6-12，其中L6-1的乙醇積累量最高，為2.71%，較出發菌株提高54.86%，經5 次傳代及保藏，其在10% NaCl的豆芽汁培養基發酵中乙醇積累量平均為2.48%，具有良好的遺傳穩定性，可以應用于醬油發酵中。

2.2 突變株L6-1與出發菌株L6性能比較

在高鹽條件下，菌株的生長性能往往會發生一些變化，如遲緩期延長、對數期生長速率降低等。為研究L6-1和L6的生長性能，分別測定其在10% NaCl豆芽汁培養基中的生長曲線，結果見圖3a。10% NaCl質量分數下，L6-1和L6同時進入和結束對數期，生長周期一致，但是L6-1菌體濃度稍高于L6。由圖3b可知，當NaCl質量分數由5%升高到16%時，L6-1和L6活菌數均下降104CFU/mL，NaCl質量分數為5%～14%的培養條件下，L6-1活菌數高于L6，而NaCl質量分數為16%的培養條件下，L6活菌數則超過L6-1，但相差不大，突變株L6-1具有較好的耐鹽能力，適合應用到醬油發酵中。接種L6-1和L6到不同NaCl質量分數的豆芽汁培養基中，發酵72 h測定乙醇積累量，結果見圖3c。隨著NaCl質量分數升高，乙醇積累量呈下降趨勢，與活菌數變化趨勢相符，說明在液體培養基中活菌數直接影響了乙醇的積累，5%～14%的NaCl質量分數下L6-1相比L6產乙醇能力明顯增強，有應用于醬油發酵的潛力。

圖3 L6與L6-1性能比較Fig.3 Comparison of growth and fermentation performance of L6 and L6-1

2.3 L6-1在高鹽稀態發酵醬油釀造中的應用

2.3.1 添加L6-1對高鹽稀態發酵醬油乙醇含量及理化指標的影響

魯氏接合酵母為醇香型酵母，可在pH 5.0～6.0的環境中生長，主要作用于醬油發酵前期，這個階段主要是原料降解、乳酸菌產乳酸、魯氏接合酵母進行乙醇發酵，過高或過低添加濃度都不利于乙醇的產生及醬油風味的形成[24]。醬醪發酵開始時pH值為6.5～7.0，發酵到25 d，pH值下降為5.5～6.0，有利于魯氏接合酵母的生長及代謝，因此發酵25 d作為添加時間。前期預備實驗發現，采用菌懸濃度107個細胞/mL、接種量5%能獲得較好的發酵效果，采用發酵至第25天的醬醪以上述菌懸濃度及接種量接種L6-1及L6，研究發酵醬醪中隨時間而變化的乙醇積累量及各項理化指標。

圖4 高鹽稀態發酵醬醪中乙醇積累量的變化Fig.4 Variations in ethanol content during high-salt liquid-state fermentation of soy sauce

醬油中的乙醇主要是由酵母菌厭氧發酵產生，乙醇能賦予醬油特有的醇香風味，并且為乙酯類風味物質的形成奠定基礎，完善醬油的風味體系，同時還可抑制雜菌生長，有利于醬油的保存，因此醬油中乙醇含量是評價釀造醬油品質的重要指標之一[25]。如圖4所示，醬醪發酵25 d添加L6-1及L6，發酵進行到45 d，乙醇積累量分別為1.00%、1.26%，分別比對照組提高78.57%、125%。發酵進行到90 d，L6-1和L6的乙醇積累量分別降到0.58%、0.71%，分別高于對照組48.72%、82.05%。L6和L6-1對醬醪中的乙醇含量均有明顯提升作用，L6在高鹽稀態醬醪（16% NaCl）中發酵積累乙醇的能力比其突變株L6-1強，這與兩株菌在16% NaCl的豆芽汁培養基中表現一致，可見，在高鹽環境中，突變株L6-1的生長能力弱于出發菌株L6，從而厭氧代謝產物乙醇的積累量略少；另外，L6-1乙醇積累量小于L6也可能是其生成的部分乙醇被進一步用于合成乙酯類物質，需要進一步研究乙酯類揮發性風味物質。

醬油發酵的理化指標主要有還原糖、總酸、氨態氮含量，其中氨態氮含量是醬油的分級標準，而總酸含量也是判斷醬油質量的重要指標。醬油發酵中還原糖含量的變化能夠反映淀粉的降解與微生物消耗還原糖之間平衡的結果，總酸是發酵過程中微生物分解糖類底物而生成的各種有機酸，氨態氮由水解蛋白質生成，氨態氮含量能夠顯示釀造醬油的呈味能力和發酵水平[26]。在發酵25 d的醬醪中接種L6-1、L6，對醬醪中還原糖、總酸和氨態氮含量進行分析。由圖5a可知，發酵0～15 d，由于淀粉酶分解碳水化合物，生成低聚糖及葡萄糖等，還原糖呈上升趨勢，之后還原糖作為主要碳源被代謝生成乙醇、高級醇與有機酸等物質，其含量開始下降，添加L6-1的醬醪還原糖含量比添加L6下降速率更快；由圖5b可知，發酵0～15 d，總酸含量迅速上升，隨后增速變緩，發酵60 d，總酸達到最高后開始下降，這一階段是有機酸類物質與乙醇等醇類物質成酯的時期，醬香在這一階段開始形成，75 d后由于芽孢桿菌等細菌的作用，總酸又出現了小幅升高，整個發酵過程中總酸質量濃度均未超過25 g/L，符合釀造醬油標準；由圖5c可知，發酵0～30 d是米曲霉蛋白酶的主要作用時期，蛋白酶水解蛋白質使氨態氮含量上升，45～75 d由于美拉德反應及微生物作用，游離氨基酸被消耗，氨態氮含量下降，75 d以后，由于細菌的作用，氨態氮含量略有升高，從發酵30 d開始，醬油氨態氮含量開始保持在7 g/L以上，達到一級釀造醬油的標準。總體而言，添加L6-1及L6發酵均有利于還原糖降解，在積累乙醇的同時對釀造醬油重要指標總酸及氨態氮的影響較小。

圖5 高鹽稀態發酵醬醪中理化指標的變化Fig.5 Variations in physicochemical indicators during high-salt liquid-state fermentation of soy sauce

2.3.2 添加L6-1對高鹽稀態發酵醬油揮發性風味物質的影響

耐鹽產乙醇酵母對醬油風味的形成發揮著關鍵作用，可在代謝過程中利用糖類等物質代謝產生乙醇、高級醇、芳香雜醇以及酮、酚等物質，醇類物質可進一步與酸類物質形成酯類香氣成分[27]。揮發性物質成分是微生物綜合作用的結果，也是衡量醬油品質的重要指標之一[28]。采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用分析樣品中揮發性物質成分，結果見圖6及表1。

圖6 高鹽稀態發酵醬油揮發性風味物質種類Fig.6 Numbers of volatile components in HLF soy sauces

發酵結束時，對照組和添加L6-1與L6發酵組的物質種類數分別為37、47、27 種。如圖6所示，添加L6-1的發酵醬油中酯類物質、醇類物質（不含乙醇）、醛類物質、酚類物質、酮類物質、酸類物質分別為17、14、5、4、4、1 種，分別比L6添加組多2、10、4、1、3、0 種。內標法定量分析計算各物質的含量，結果見表1，可以看出L6-1、L6、對照組的發酵醬油中醇類含量分別為1 507.87、1 743.72、1 177.63 ng/g，L6-1添加組與L6添加組分別較對照組提高28.04%、48.07%；雖然添加L6-1發酵醬油醇類物質總含量比添加L6醬油低，但添加L6-1的醬油中醇類物質種類更加豐富；酯類物質種類分別為17、15、17 種，含量分別為828.72、583.72、518.56 ng/g，L6-1添加組與L6添加組在酯類物質種類差別不大的情況下，其含量分別較對照組提高59.81%、12.57%，其中L6-1添加組乙酯類物質含量最高，為605.64 ng/g，比添加L6及對照組的發酵醬油分別提高6.79%及20.61%。結合其乙醇積累量的變化可知，L6-1積累的乙醇部分被用來合成乙酯類揮發性風味物質，增加了醬油香氣的豐富度，因此添加L6-1有利于醬油香氣成分的多樣性。

結合表1可知，醇類物質中，具有玫瑰花香的苯乙醇在3 種發酵醬油中都有檢測到，添加L6-1發酵醬油中含量最高為1 217.78 ng/g，分別比對照組與添加L6的發酵醬油高出52.57%、9.21%，有肉湯香的3-甲硫基丙醇在對照組與添加L6-1的醬油中都有檢測到，具有蘑菇香的3-辛醇、常用作食用香料的二異丁基甲醇只在添加L6-1的醬油中檢測到，雖然這3 種物質含量低，但其香氣閾值低，對醬油香氣貢獻大；酯類物質中，具有玫瑰香氣的乙酸苯乙酯只在添加L6-1的發酵組中檢測出，另外添加L6-1的醬油中一些重要的乙酯類香氣物質苯甲酸乙酯（水果氣味）、琥珀酸二乙酯（食品加香劑）、辛酸乙酯（水果香）、乙酸苯乙酯（煙草、玫瑰香）、癸酸乙酯（葡萄香）、月癸酸乙酯（樹葉香）、十四酸乙酯（鳶尾油香）、棕櫚酸乙酯（蠟香）的含量均不同程度高于其他實驗組，它們可緩沖醬油的咸味并通過抑制胺類和部分脂肪酸類物質的刺激感及苦味賦予醬油良好的風味[29]；醛類物質中，苯乙醛在3 種發酵醬油中都有檢測出，L6對苯乙醛有提升作用，但具有杏仁味的糠醛、苯甲醛和具有可可香味與水果香味的2-苯基巴豆醛、異戊醛只在添加L6-1的醬油中檢測到；酚類物質中，L6對異丁香酚、4-乙基愈創木酚均有提升作用，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚與麥芽酚只在添加L6-1的醬油中檢測出，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚具有丁香味，麥芽酚有焦奶油硬糖的味道，起到增香、固香、增甜的作用，對醬油香氣影響較大[30]。揮發性風味物質的定量分析結果說明添加L6-1能夠促進醬油風味物質的形成，提高醬油風味物質的豐富度。

表1 高鹽稀態發酵醬油揮發性風味物質成分及含量Table 1 Volatile flavor compositions of HLF soy sauces

續表1

對發酵醬油的揮發性風味物質進一步進行主成分分析，從醇類、酯類、醛類、酚類、酮類、酸類、其他物質七大類物質中提取出2 個主成分，各主成分的貢獻率及總貢獻率如表2所示，所提取的2 個主成分總貢獻率達到100.00%，能充分解釋各個原始成分。各主成分載荷圖如圖7所示，在PC1軸上，醇類、醛類、酮類、酸類的相關性系數較大，因此可用PC1解釋這4 類物質，其中醇類、醛類及酮類物質呈正相關，而酸類物質呈負相關；PC2軸顯示，酯類、酚類、其他物質的相關性系數較大，因此可用PC2解釋這3 類物質。

表2 主成分方差貢獻情況Table 2 Contribution rates of principal components to total variance

圖7 主成分載荷圖Fig.7 Loading plot of principal components

計算各變量的主成分得分系數并計算各主成分得分，得到最終總得分計算公式：F總=0.737F1＋0.263F2，各醬油樣品主成分得分及總得分如表3所示。

表3 醬油樣品主成分得分Table 3 Principal component scores of soy sauces

由表3可看出，總得分對照組最低，則L6-1與L6對醬油的風味呈正向貢獻，且L6-1得分最高，因此，突變株L6-1有明顯提升醬油風味的作用。L6在PC1上得分較高，PC1與醇類、醛類、酮類的相關性系數較大，說明L6對此三類物質貢獻較大；L6-1在PC2上得分較高，PC2與酯類、酚類、其他的相關性系數較大，同時PC1上也有較好得分，由于PC1得分的權重系數為0.737，L6-1的總得分與PC1和PC2都有較大相關性，說明L6-1除醇類、醛類、酮類物質貢獻較大外，酯類、酚類、其他類物質的貢獻也較大。綜合乙醇積累量、揮發性風味物質種類、含量及貢獻度，可以發現，突變株L6-1接入醬醪后，除提高乙醇為主的醇類化合物種類和含量之外，還對醬油重要的香氣成分酯類，特別是乙酯類物質的形成起到了重要的促進作用，有效地豐富了釀造醬油的風味。

3 結 論

醬油釀造由傳統的曬露法及低鹽固態發酵發展為現代高鹽稀態發酵，其封閉的發酵設備大幅減少了污染菌的質量安全風險，同時也影響了釀造醬油的風味。以魯氏接合酵母L6為出發菌株，經紫外誘變選育了1 株在10% NaCl豆芽汁培養基中能很好積累乙醇的突變株L6-1，16% NaCl高鹽稀態發酵醬醪中對比研究L6-1和L6，發現醬醪發酵45 d時兩株菌乙醇含量均達到了最高，分別比對照組提高了78.57%和125%，隨著發酵的進行，其乙醇積累量有所下降；揮發性風味物質定量分析發現，添加L6-1的發酵醬油除乙醇外的醇類物質以及酯類物質（特別是乙酯類物質）的豐富度均好于L6，其中乙酯類風味物質含量最高為605.64 ng/g，比添加L6及對照組的發酵醬油分別提高了6.79%及20.61%；主成分分析并評分發現，添加突變株L6-1的發酵醬油得分最高，進一步說明了L6-1除提高醬油乙醇含量外，對醬油風味物質的豐富度及風味具有良好的促進作用。選育耐鹽產乙醇酵母，能促進醬醪發酵中乙醇及乙醇為底物的乙酯及其他物質的積累，在提高醬油醇香風味的同時有效提升了醬油風味的豐富度，這為今后醬油釀造風味菌的選育提供了一條圍繞核心代謝產物選育的思路，將更有效地提升釀造醬油的品質。

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