菌種對發酵紅茶水溶液香氣品質的影響

林 琦，李利君,2,3，伍 菱,2,3，黃高凌,2,3,，翁淑燚，倪 輝,2,3，李清彪,2,3，張樹文，黃幼林

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021；4.大閩食品（漳州）有限公司，福建 廈門 361021；5.集美大學理學院，福建 廈門 361021）

茶葉是我國重要的農產品，按照加工工藝的不同，茶葉可分為白茶、綠茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶共6大類。紅茶是一類傳統的茶葉，屬于全發酵茶，近年來產量快速增長，根據國際茶葉委員會統計數據顯示，2018年全球紅茶產量600萬 t，比2017年全球紅茶產量增加了15.8萬 t。相關研究表明，紅茶富含多種生物活性物質，具有減肥消炎[1]、保護神經[2]、預防心血管疾病[3]的功能。相關研究表明，茶葉水溶液經過微生物發酵后，不僅具有顯著的抗氧化性和抗菌性等功能[4]，而且具有特殊的風味[5]。例如，采用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多菌種混合發酵的紅茶菌[6]，具有預防糖尿病、改善腸道微生物，治療非酒精性脂肪肝等功能[7-8]，并產生了豐富的醇類、醛類、酮類、酸類、酯類等物質[9]，使發酵后的茶葉具有更好的風味。因此，利用微生物發酵增加茶葉水溶液及茶飲料的生物活性及風味日漸成為茶葉深加工的重要技術手段。目前，相關研究對微生物發酵引起的茶葉活性進行了大量研究，在此基礎上，深入研究微生物發酵對香氣的影響，將進一步促進高質量茶葉產品的開發。

目前常見的香氣萃取方式有頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）、超聲輔助萃取[10]、攪拌棒吸附萃取[11]、同時蒸餾萃取[12]、靜態頂空[13]、溶劑輔助蒸發[14]、液液萃取[15]、超臨界萃取[16]、動態頂空[16]等，其中，SPME具有人工操作快速、簡單，集萃取、濃縮和進樣于一體的優點。香氣成分分析檢測方法包括氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[12]、氣相色譜-嗅聞[11]、氣相色譜-飛行時間質譜[17]、電子鼻[18]、氣相色譜-燃燒同位素比值質譜法[19]、氣相色譜-氫火焰離子化法[20]等，其中GC-MS既有質譜的高靈敏度和氣相色譜的高分辨率，又能準確進行定性和定量分析[21]。相關學者通過HS-SPME結合GC-MS分析研究，發現乳酸菌發酵后，鐵觀音浸提液的醇類、酮類和酯類香氣成分在發酵后較發酵前有明顯增加[22]；Pripdeevech等[5]采用HS-SPME結合GC-MS分析，研究發現烏龍茶經過枯草芽孢桿菌發酵后主要揮發性成分顯著增加。但是，目前對發酵茶葉水溶液及茶飲料風味隨菌種變化的規律缺乏系統對比研究。

本研究以紅茶水溶液為對象，分別用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌進行發酵，并采用感官評價和HS-SPME結合GC-MS對比分析各菌種對茶葉香氣的影響，旨在豐富發酵菌種對發酵茶葉水溶液及茶飲料風味影響的風味基礎，同時為通過菌種優化而調控發酵紅茶飲料的風味質量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶葉 莆田市天林茶葉有限公司；正構烷烴（C8～C20）、環己酮（1 g/mL）、β-月桂烯、順式-3-乙烯醇、1-乙基吡咯、芳樟醇氧化物和順-3-己烯基丁酸酯美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇（優級純） 國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖（食品級） 廈門古龍食品有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（食品級）安琪酵母股份有限公司；果醋醋桿菌（Acetobacter acetigenoideum）（食品級） 煙臺帝伯仕自釀機有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（食品級） 山東中科嘉億生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

QP-2010 Plus GC-MS儀 日本島津公司；Rtx-5MS毛細管色譜柱（60 mm×0.32 mm，0.25 μm）美國Restek公司；HH-157330-U手動SPME進樣器、75 μm CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵紅茶水溶液的制備

按茶水比1∶100（g/mL），90 ℃沖泡3 min。制備1 500 mL紅茶水溶液，沖泡過程中用保鮮膜封口。沖泡完成后，冷卻到室溫，過濾茶渣得到紅茶水溶液。接著加入7%的蔗糖，將紅茶水溶液分裝成每瓶為150 mL。將調配好紅茶水溶液在沸水浴中，滅菌15 min，并將其迅速冷卻至30 ℃。滅菌中用12 層紗布包住。取其中的3 瓶紅茶水溶液，分別向其加入0.1%酵母菌、0.1%醋酸菌、0.1%乳酸菌，于30 ℃的恒溫培養箱中，培養3 d。每種菌種做3 個平行實驗。發酵結束后，立即放入冰箱中冷藏。以原紅茶水溶液作為空白對照樣品。

1.3.2 發酵紅茶水溶液香氣輪廓的分析

發酵完成后，根據ISO 8589標準和相關文獻方法建立紅茶發酵液氣味特征感官評價標準表（表1），配制一系列不同濃度的香氣標準品。選擇10 名感官評價人員（具有3 個月以上感官評價的經驗）包括5 名女性和5 名男性，對紅茶發酵液及原紅茶水溶液進行感官評價，其中1 分表示香氣強度較低，4 分表示香氣強度中等，9 分表示香氣強度較高。評價過程中，室溫保持（25±2）℃，相對濕度在50%～75%之間，室內無其他氣體干擾并保持通風。

表1 標準溶液的氣體特征與強度Table 1 Aroma characteristics and strength of volatile standard solutions μg/L

1.3.3 發酵紅茶水溶液揮發性成分的定性分析

準確量取10 mL樣液置于50 mL萃取瓶中，再加入20 mL的超純水和10 μL的內標物環己酮，混勻之后將萃取瓶放入40 ℃水浴鍋中平衡1 h，最后將老化后的固相微萃取頭插入萃取瓶中吸附20 min。

色譜條件：色譜柱為Rtx-5MS（60 m×0.32 mm，0.25 μm），用高純氦氣（純度99.999%）作為載氣，柱流量為3 mL/min，不分流進樣。升溫程序：程序升溫，進樣口溫度為230 ℃；初溫度為50 ℃并保持5 min，以3 ℃/min升溫至200 ℃，在200 ℃保持1 min。

質譜條件：離子源溫度為200 ℃，電離方式為電子電離源，電離能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，選擇SCAN模式為掃描方式進行定性分析，離子碎片的掃描范圍為m/z35～500。溶劑延遲時間為2.5 min。

定性分析：采用質譜數據庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）進行相似度檢索，計算樣品中揮發性成分的保留指數與文獻報道的保留指數進行比對以及特征離子碎片等進行定性分析，其中保留指數運算參照Kratz和Vandendool的方法。

式中：RI為保留指數；TR為保留時間；x為待測組分；n和n＋1分別為待測組分出峰前后相鄰的兩個正構烷烴的碳原子數。

1.3.4 發酵紅茶水溶液揮發性成分的定量分析

采用內標法進行定量分析，將已知濃度的內標物環己酮和一定含量的待分析樣品混勻后，再對含有內標物的待測樣品進行色譜分析，根據待測樣品和內標物的峰面積，按照式（2）計算待測組分在樣品中的含量。

1.4 數據統計與分析

使用Excel 2013對不同菌種發酵紅茶水溶液的揮發性成分進行統計分析，制作感官評價雷達圖、柱狀圖。使用加權平均法對香氣輪廓進行統計學分析。使用SPSS 22.0對不同菌種發酵紅茶水溶液的揮發性成分進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同菌種發酵處理對紅茶水溶液香氣輪廓的影響結果

圖1 不同菌種發酵紅茶水溶液的感官評價雷達圖Fig.1 Sensory evaluation radar map of black tea infusion fermented by different strains

如圖1所示，酵母菌、醋酸菌、乳酸菌對紅茶水溶液的花香、甜香、青草香、果香和烘烤香都有顯著影響，其中酵母菌、醋酸菌、乳酸菌發酵紅茶水溶液后，紅茶水溶液的果香顯著增加，而花香、甜香和青草香降低；此外，用酵母菌、乳酸菌發酵可顯著降低烘烤香，而醋酸菌卻顯著增加了紅茶水溶液的烘烤香。有研究表明乳酸菌發酵果蔬汁增加了果香味[23]；Mukisa等[24]采用酵母菌和乳酸菌生產高粱發酵飲料，果香顯著增加；Tu Chunhai等[25]利用紅茶菌發酵大豆乳清，產生了新的芳香活性物質，使大豆乳清具有果香味。該結論與本實驗相似。

進一步分析表明（圖2），乳酸菌發酵紅茶水溶液的可接受程度最高，通過加權平均法，以及與3 種菌種發酵紅茶水溶液的香氣輪廓結合進行分析，其分值為6.3。加權分析法是指在計算若干個數量的平均數時，為了考慮每個數量在總量中具有的重要性不同，可分別給予不同的權數，按不同的權數計算所得的各數量的平均數[26]。有研究采用加權平均法表述菌落總數測定的數學模型[26]。因此，本實驗在一般的加權平均法的基礎上稍作改進，對花香、甜香、青草香、果香和烘烤香給予不同的權數，通過式（3）[27]進行回歸分析，經計算得出，x1=1.22，x2=0.09，x3=－0.23，x4=0.39，x5=－0.47。可知花香、甜香和果香對可接受程度影響為正相關，青草香和烘烤香對可接受程度影響為負相關，其中增加果香、甜香和花香，降低青草香和烘烤香是提高紅茶水溶液可接受程度的主要因素。

式中：x1為花香的權數；x2為甜香的權數；x3為青草香的權數；x4為果香的權數；x5為烘烤香的權數； 為可接受程度值。

圖2 不同菌種發酵紅茶水溶液的可接受程度值Fig.2 Acceptability scores of black tea infusion fermented by different strains

2.2 不同菌種對紅茶水溶液揮發性成分的定性分析

如圖3和表2所示，共鑒定出73 種揮發性成分，包括酯類23 種，醇類18 種，醛類8 種，烯烴類6 種，酮類7 種，酸類5 種和其他6 種。原紅茶水溶液中共鑒定出30 種揮發性成分，包括醇類8 種，烯烴類6 種，醛類8 種，酯類4 種，酮類1 種和其他3 種，由此可知其主要揮發性成分為醇類、烯烴類和醛類。盧艷等[28]將GC-MS采集的質譜圖與NIST 08標準質譜庫進行對照，并結合文獻對比，進行定性，表明正山小種中的香氣成分有醇類、醛類、酮類和酯類等，與本實驗結果有一定的差異，其可能是原料及測定方法不同等原因。酵母菌發酵紅茶水溶液中共鑒定出46 種揮發性成分，其中醇類13 種，酯類18 種，酸類5 種，烯類3 種，醛類3 種，酮類3 種和其他1 種，由此可知其主要揮發性成分為醇類和酯類。鄒聰麗[29]采用質譜計算機數據系統檢索進行定性分析，研究表明酵母菌發酵紅茶水溶液后主要香氣成分由醇類和醛類變為醇類物質和酯類物質，呈現出顯著的酒香味和果香味，與本實驗結果一致。醋酸菌發酵紅茶水溶液中共鑒定出33 種揮發性成分，其中醇類16 種，醛類5 種，酯類3 種，烯類2 種，酸類1 種，酮類3 種和其他3 種，由此可知其主要揮發性成分為醇類和醛類。張義杰等[30]通過Nist 08數據庫進行定性分析，研究表明醋酸菌發酵西瓜汁的主要揮發性成分為醇類、酯類、醛類和酸類，果香味顯著增加，也具有青草香、花香和甜香，和本實驗結果相符。乳酸菌發酵紅茶水溶液中共鑒定出32 種揮發性成分，醇類11 種，醛類7 種，酯類6 種，酮類4 種，烯類2 種和其他2 種，由此可知其主要揮發性成分為醇類、酯類、醛類和酮類。劉佳奇等[31]通過Agilent Mass Hunter進行數據采集和分析，并通過Central Authentication Service（CAS號）及配比度進行定性，研究表明植物乳桿菌發酵紅茶水溶液得到的香氣成分主要有醇類和酮類，與本實驗結果相似。

圖3 不同菌種發酵紅茶水溶液中揮發性成分的總離子流圖Fig.3 Total ion flow chromatograms of volatile components in black tea infusion fermented by different strains

表2 不同菌種發酵紅茶水溶液中揮發性化合物的定性結果Table 2 Qualitative results of volatile compounds in black tea infusion fermented by different strains

續表2

2.3 不同菌種對紅茶水溶液揮發性成分的定量分析

如表3所示，酵母菌、醋酸菌、乳酸菌發酵紅茶水溶液產生的揮發性成分的種類和含量有所差異，與原紅茶水溶液相比，增加了一些揮發性成分。原紅茶水溶液的揮發性成分為醇類（60.13 μg/L）、酯類（35.81 μg/L）、酮類（6.22 μg/L）、醛類（115.13 μg/L）、烯烴類（239.56 μg/L）和其他（40.40 μg/L），其含量較高為順式-3-己烯醇（21.07 μg/L）、苯甲醛（39.61 μg/L）、壬醛（24.51 μg/L）、檸檬烯（178.42 μg/L）、萜品烯（28.36 μg/L），其中苯甲醇、香葉醇、苯乙醇、水楊酸甲酯、糠醛是其主要的香氣物質[28]，糠醛具有烘烤香和甜香[34]，苯甲醛具有焦糖香[34]，苯甲醇具有花香和甜香[34]，檸檬稀具有青草香[35]和果香[36]，苯乙醇具有花香和甜香[34]，順式-3-己烯醇具有青草香[34]，這些物質的香氣特征和實驗結果感官檢驗的紅茶香氣特征一致。

酵母菌發酵紅茶水溶液產生的揮發性成分最多，增加了醇類物質（1 605.93 μg/L）、酯類物質（7 715.82 μg/L）和酸類物質（596.15 μg/L），降低了醛類物質（69.48 μg/L），且酯類物質和醇類物質含量最高，對氣味特征貢獻較大。其中紅茶的主體香氣成分苯乙醇、水楊酸甲酯的含量顯著增加，增加了紅茶的主體香味，己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和辛酸是果酒中的主要香氣成分[37]。如圖4所示，酵母菌發酵紅茶水溶液中酯類物質占揮發性成分的73%，顯著增加；與原茶水溶液以及醋酸菌和乳酸菌發酵紅茶水溶液相比，酸類物質含量較高，而其他物質含量顯著降低，因此，果香顯著增加，而花香、青草香、甜香和烘烤香顯著降低。這也是酵母菌發酵紅茶水溶液可接受程度低于乳酸菌發酵紅茶水溶液的主要原因。

醋酸菌發酵紅茶水溶液增加了醇類物質（178.33 μg/L）和酮類物質（14.15 μg/L），降低了烯烴類物質（19.37 μg/L），其酯類物質和醛類物質含量最高，對氣味特征貢獻較大。如圖4所示，醇類物質和醛類物質相對含量高達67%，與酵母菌和乳酸菌發酵紅茶水溶液相比，酯類物質含量降低，與原紅茶水溶液相比，酯類物質含量增加；烯烴類物質與原紅茶水溶液相比顯著降低；酮類物質與乳酸菌發酵紅茶水溶液相比顯著降低。苯乙醇具有烘烤香，壬醛具有油脂香，順式-3-己烯醇具有木香和蘑菇香[38]，香葉醇具有花香，且醇類物質具有果香[39]，檸檬烯具有青草香，其含量顯著降低。因此，這些成分變化與醋酸菌增加紅茶水溶液的烘烤香和果香，降低了花香、青草香和甜香的結果一致，也使其可接受程度最低。

乳酸菌發酵后，紅茶水溶液增加了醇類物質（90.70 μg/L）、酯類物質（53.91 μg/L）和酮類物質（19.82 μg/L），降低了烯烴類物質（10.89 μg/L）。劉佳奇等[31]研究表明植物乳桿菌發酵紅茶水溶液得到的香氣成分主要有醇類物質和酮類物質，與本實驗結果一致。其中產生的新物質中，肉桂酸乙酯具有淡的甜蜂蜜香味和肉桂香味，十一酮具有桃子香[31]，酯類和高級醇具有果香[39]，總相對含量為53%；此外，檸檬烯含量和苯甲醛含量降低，苯甲醛具有花香和甜香，檸檬烯具有青草香。如圖4所示，酯類物質、醇類物質、酮類物質和醛類物質總相對含量為86%，與原紅茶水溶液以及酵母菌和醋酸菌發酵紅茶水溶液相比，醇類物質、酮類物質和醛類物質都顯著增加；而與原紅茶水溶液和醋酸菌發酵紅茶水溶液相比，酯類物質顯著增加；烯烴類物質與原紅茶水溶液相比顯著降低。因而，乳酸菌發酵紅茶水溶液果香增加，且降低花香、青草香、甜香和烘烤香的結果與這些成分變化的規律一致。根據感官評價得知，增加果香、甜香和花香，降低青草香和烘烤香是提高紅茶水溶液可接受程度的主要因素。乳酸菌發酵紅茶水溶液后，與酵母菌和醋酸菌發酵紅茶水溶液相比，花香和甜香的降低程度小，其與原紅茶水溶液較為接近。且果香增加，烘烤香減低，因此其可接受程度最高。

表3 不同菌種發酵紅茶水溶液中揮發性化合物的定量結果Table 3 Quantitative results of volatile components in black tea infusion fermented by different strains

續表3

圖4 不同菌種發酵紅茶水溶液的揮發性成分含量差異圖Fig.4 Comparison of concentrations of various classes of volatile components in black tea infusion fermented by different strains

3 結 論

香氣輪廓分析表明，酵母菌發酵可顯著增加紅茶水溶液果香，并降低花香、青草香、甜香和烘烤香；醋酸菌發酵可增加紅茶水溶液烘烤香和果香，并降低花香、青草香和甜香；乳酸菌發酵可增加紅茶水溶液果香，降低花香、甜香、青草香和烘烤香。香氣接受程度綜合分析表明，乳酸菌發酵后紅茶水溶液的香氣可接受程度最高，而醋酸菌和乳酸菌發酵會降低紅茶水溶液的香氣可接受程度。加權平均法進行分析表明，紅茶水溶液的香氣可接受程度的增加與果香、甜香和花香增加及青草香和烘烤香降低密切相關。GC-MS分析表明酵母菌發酵后紅茶水溶液香氣接受程度的提高與醇類物質、酯類物質和酸類物質增加及醛類物質降低有關；醋酸菌發酵后紅茶水溶液香氣的變化與醇類物質和酮類物質增加及烯烴類物質降低有關；乳酸菌發酵后紅茶水溶液香氣改變與醇類物質、酯類物質和酮類物質含量增加及烯烴類物質減少有關。該研究為提高紅茶的產品風味提供了研究參考。