梨黑斑鏈格孢菌次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定及毒素含量分析

盧春珍 萬傳星*

（1新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

鏈格孢屬是以細(xì)鏈格孢菌（A.tenuissima）為模式種建立起來的半知菌亞門鏈格孢屬（Alternaria）真菌［1］。截止目前，全世界已經(jīng)發(fā)表的鏈格孢菌屬真菌約736個(gè)種，且有新種在不斷發(fā)表。絕大數(shù)的鏈格孢菌具有病原和腐生的特質(zhì)，普遍存在于環(huán)境中，主要寄生于瓜果、蔬菜、糧食及飼料作物等，是引起農(nóng)產(chǎn)品腐爛變質(zhì)的主要病原真菌。鏈格孢菌能夠引起多種植物病害，如蘋果鏈格孢菌引起蘋果的輪斑病、番茄鏈格孢菌引起番茄的莖枯病、菊池鏈格孢菌引起梨的黑斑病、蕓薹鏈格孢引起白菜的黑斑病以及梨黑斑鏈格孢菌引起梨的黑斑病等［2］，嚴(yán)重影響作物、瓜果、蔬菜的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)收入。

鏈格孢菌可產(chǎn)生生物毒素類化合物，目前檢測出的鏈格孢菌毒素達(dá)70余種［3］。鏈格孢菌毒素按寄主專化性可分為兩類，即選擇性毒素和非選擇性毒素。按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為四種類型：（1）二苯并吡喃酮類衍生物，代表性毒素有交鏈格孢酚、交鏈格孢酚單甲醚、交鏈孢烯；（2）四氨基酸衍生物類，代表毒素有細(xì)交鏈孢菌酮酸；（3）少量的鏈格孢霉代謝物苝醌類，代表毒素有交鏈孢毒素；（4）一系列長鏈氨基多元醇的丙三羧酸酯類化合物。研究較多的毒素為交鏈格孢酚、交鏈格孢酚甲基醚和騰毒素等［4-8］。這些毒素具有致病、致畸、致突變的特性［9-11］，對人、畜健康造成隱患。

新疆是我國紅棗、蘋果、香梨、葡萄等果品的重要產(chǎn)區(qū)，鏈格孢菌不但廣泛引起諸如紅棗黑頭病、蘋果和梨黑斑病等大田危害，而且鏈格孢菌所產(chǎn)毒素具有“致癌、致畸和致突變”等慢性毒性，對新疆果品的品質(zhì)和食用安全提出嚴(yán)重挑戰(zhàn)，近幾年，歐美和韓日諸國突然加速了對鏈格孢菌毒素檢測分析的研究，歐盟還擬將該類毒素的檢測納入限量標(biāo)準(zhǔn)，然而我國對此類毒素結(jié)構(gòu)的分離鑒定和檢測分析尚不系統(tǒng)，亟待加強(qiáng)。為此，本研究對一株源于庫爾勒香梨的梨黑斑鏈格孢菌（Alternaria gaisen）進(jìn)行了次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定，并比較分析梨鏈格孢菌利用庫爾勒香梨、蘋果、西紅柿、馬鈴薯、大米、燕麥等不同營養(yǎng)基質(zhì)后的產(chǎn)毒含量，以期對新疆乃至全國果品鏈格孢菌毒素的監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司，含LC-20AT二元高壓梯度泵，SPD-M20A紫外檢測器，Labsolutions色譜工作站）；Agilent HPLC色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司）；Waters制備液相色譜儀（美國Water公司，Waters 2489紫外檢測器，Waters 2545二元高壓梯度泵）。D101大孔樹脂（天津浩聚公司）；SpehadexLH-20（Pharmacia公司）：核磁共振儀500 MHz（瑞士BRUKER公司）；色譜級甲醇（北京百靈威有限公司）。

1.2 提取與分離

1.2.1 供試菌株

分離自庫爾勒香梨的一株梨黑斑鏈格孢菌（Alternaria gaisen），由塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張銳利老師惠贈(zèng)。

1.2.2 培養(yǎng)基

產(chǎn)孢培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，瓊脂16 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L。

種子培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：①馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；②庫爾勒梨200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；③西紅柿200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；④大米200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；⑤燕麥200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；⑥蘋果200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L。

1.2.3 發(fā)酵液的制備

1.2.2 提出護(hù)理問題 胸椎骨折手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大,術(shù)后并發(fā)癥多,會(huì)不同程度降低患者生活質(zhì)量。循證護(hù)理小組通過與患者及家屬深入交流,了解患者需求,結(jié)合護(hù)理經(jīng)驗(yàn)和患者病情,提出亟需解決的術(shù)后護(hù)理問題,主要包括:胸椎骨折術(shù)后容易發(fā)生哪些并發(fā)癥?如何有效預(yù)防和減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生,改善患者預(yù)后?

活化梨黑斑鏈格孢菌，接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d。采用PDB種子液培養(yǎng)基，用無菌打孔器在培養(yǎng)基中打孔，挑取四塊菌餅接種于種子液培養(yǎng)基中，28℃、180 rpm搖床培養(yǎng)3 d即為種子液。發(fā)酵培養(yǎng)液為上述培養(yǎng)基，其中以庫爾勒香梨為主要營養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)液發(fā)酵15 L，其余五種營養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)液分別發(fā)酵3 L，采用500 mL三角瓶，裝液量為150 mL，每瓶接種4個(gè)菌餅，28℃、180 rpm搖床培養(yǎng)7 d。

1.2.4 次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定

將15 L梨黑斑鏈格孢菌發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾，使菌絲體與濾液分離，濾液通過D101大孔樹脂柱進(jìn)行吸附，蒸餾水洗脫后，依次用30%，50%，70%，100%的甲醇進(jìn)行洗脫，收集50%、70%、100%三個(gè)濃度梯度甲醇洗脫液，濃縮后得到浸膏A 203 g，菌絲體用甲醇熱回流提取3次，每次不低于0.5 h，將3次得到的提取液合并濃縮，得到浸膏B 134 g，通過HPLC分析后A、B無明顯差異將其合并，得總浸膏237 g。采用硅膠柱層析、制備高效液相色譜等方法，分離鏈格孢菌次生代謝產(chǎn)物，并通過1D&2D NMR技術(shù)鑒定梨鏈格孢菌次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 不同營養(yǎng)條件毒素含量分析方法

將分離自梨黑斑鏈格孢菌的4個(gè)毒素類化合物配置成1.0 mg/mL母液，倍性稀釋為1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL等系列濃度作標(biāo)準(zhǔn)品溶液。HPLC分析條件為：檢測波長254 nm，進(jìn)樣量8 μL，流動(dòng)相60%甲醇-水，時(shí)間35 min，通過面積歸一法測得標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。

將上述4個(gè)毒素類化合物進(jìn)行混合標(biāo)品HPLC分析（如圖1所示），可基于標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測不同營養(yǎng)基質(zhì)條件下發(fā)酵物中毒素含量。

圖1 4種鏈格孢菌毒素成分HPLC分析色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 梨鏈格孢菌次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淺褐色粉末，分子式C15H16O6。1H-NMR（ 500 MHz,DMSO-d6）δ:6.51（1H,d,J=2.0 Hz,H-4）,6.76（1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,2.27（1H,dd,J=13.0 Hz,J=3.0 Hz,H-3′）,1.96（1H,dd,J=13.0 Hz,J=7.5 Hz,H-3′）,3.70（1H,m,H-4′）,3.95（1H,m,H-5′）,6.32 （1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,3.86（3H,s,H-5-OCH3）,1.47（3H,s,H-2′-CH3）,5.31（1H,d,J=6.5 Hz,H-5′-OH）,5.14（1H,d,J=6.5 Hz,H-4′-OH）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:139.7（C-1）,100.5（C-2）,163.5（C-3）,101.4（C-4）,166.3（C-5）,102.9（C-6）,168.7（C-7）,132.3（C-1′）,81.2（C-2′）,39.0（C-3′）,69.3（C-4′）,69.9（C-5′）,131.5（C-6′）,56.3（5-OCH3）,27.9（2′-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致［12-13］，故確定化合物1為交鏈孢烯（Alternuene）。

化合物3：為褐色無定型粉末，分子式為C14H10O6。1H-NMR（500 MHz,DMSO-d6）δ:6.53（1H,d,J=1.5 Hz,H-4）,7.01（1H,d,J=1.5 Hz,H-6）,6.79（1H,s,H-3′）,7.52（1H,d,J=1.5 Hz,H-6′）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:137.9（C-1）,98.9（C-2）,164.1（C-3）,100.4（C-4）,167.1（C-5）,98.3（C-6）,165.4（C-7）,109.4（C-1′）,144.6（C-2′）,103.8（C-3′）,149.6（C-4 ）,144.1（C-5′）,109.4（C-6′）,56.4（5-C-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致［18-20］，故確定化合物3為鏈格苝醇（Alternuisol）。

化合物4：黃色粉末，分子式C15H12O5。1HNMR（500 MHz,DMSO-d）δ:6.44（ 1H,d,J=2.0 Hz,H-4）,7.17（1H,d,J=2.0 Hz,H-6）,6.57（1H,d,J=2.0 Hz,H-3′）,6.68（1H,d,J=2.0 Hz,H-5′）,3.85（3H,s,H-OCH3）,2.68（3H,s,H-CH3）,11.85（H-3-OH）,9.12（H-4′-OH）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:138.2（C-1）,98.9（C-2）,165.2（C-3）,99.0（C-4）,165.0（C-5）,103.6（C-6）,166.6（C-7）,109.7（C-1′）,153.2（C-2′）,101.8（C-3）,158.5（C-4′）,117.5（C-5′）,138.7（C-6′）,55.3（5-C-OCH3）,24.7（C-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致［21-22］，故確定化合物4為交鏈格孢酚單甲醚（Aternariol methyl ether）。

化合物5：白色粉末，分子式：C8H8O3。1H-NMR（500 MHz,DMSO-d6）δ:6.01（1H,s,H-2）,3.89（1H,dd,J=2.6 Hz,J=7.0 Hz,H-5）,4.50（1H,dd,J=2.6 Hz,J=7.0Hz,H-5）,6.72（1H,dd,J=7.2 Hz,J=15.0 Hz,H-6）,6.37（1H,dd,J=2.0 Hz,J=15.0 Hz）,1.89（3H,dd,J=1.5 Hz,J=7.0 Hz,H-8）,5.79（H-4-OH）,5.67（H-5-OH）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:204.1（C-1,125.2 C-2）,168.9（C-3）,81.1（C-4）,76.8（C-5）,139.7（C-6）,125.9（C-7）,19.6（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致［23-24］，故確定化合物5為土曲霉酮（Terrein）。

化合物6：淡黃色粉末，分子式：C9H11O3N。HNMR（500 MHz,DMSO-d6）δ:6.09（1H,d,J=2.0 Hz,H-2）,6.03（1H,d,J=2.0 Hz,H-4）,6.03（1H,d,J=2.0 Hz）,3.50（1H,s,H-7）,2.07（3H,s,H-9）;13C-NMR（125 MHz,DMSO-d6）δ:158.8（C-1）,101.4（C-2）,158.8（C-3）,107.9（C-4）,136.9（C-5）,107.9（C-6）,50.6（C-7）,206.6（C-8）,29.6（C-9）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結(jié)合HSQC、HMBC譜，將NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬，鑒定化合物6為7-氨基-1,3-二羥基-苯丙酮（7-amino-1,3-dihydroxy-propiophen）［25］。

2.2 不同營養(yǎng)條件下毒素成分含量分析

4種鏈格孢菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)，如表1所示：

表1 4種鏈格孢菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖2 梨黑斑鏈格孢菌利用不同營養(yǎng)基質(zhì)所產(chǎn)毒素成分含量的比較

梨黑斑鏈格孢菌利用不同營養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)度含量分析結(jié)果如圖2所示，梨鏈格孢菌利用不同營養(yǎng)物質(zhì)，所產(chǎn)主要生物毒種類相同，但毒素的含量存在明顯差異。梨鏈格孢菌以庫爾勒香梨、馬鈴薯、西紅柿為營養(yǎng)時(shí)的毒素含量明顯高于以大米、燕麥、蘋果為營養(yǎng)時(shí)的毒素含量。對于交鏈格孢酚，以西紅柿作為培養(yǎng)基時(shí)含量最高，為102.5 μg/mL；以庫爾勒香梨為培養(yǎng)基時(shí)含量次之，為83.2 μg/mL；以蘋果為培養(yǎng)基時(shí)含量最少，為23.2 μg/mL。對于交鏈格孢酚單甲醚，以庫爾勒香梨作為培養(yǎng)基時(shí)含量最高，為92.1 μg/mL；以西紅柿為培養(yǎng)基時(shí)含量次之，為87.9 μg/mL；以大米為培養(yǎng)基時(shí)含量最少，為27.4 μg/mL。對于鏈格苝醇，以西紅柿作為培養(yǎng)基時(shí)含量最高，為77.3 μg/mL；以庫爾勒香梨為培養(yǎng)基時(shí)含量次之，為67.7 μg/mL；以燕麥為培養(yǎng)基時(shí)含量最少，為34.5 μg/mL。對于交鏈孢烯，以馬鈴薯作為培養(yǎng)基時(shí)含量最高，為105.5 μg/mL；以庫爾勒香梨為培養(yǎng)基時(shí)含量次之，為64.5 μg/mL；以大米為培養(yǎng)基時(shí)含量最少，為18.4 μg/mL。

3 小結(jié)與討論

由鏈格孢菌引起的梨果實(shí)上的黑斑病是重要的儲(chǔ)藏期病害，在果實(shí)表面形成圓形或不規(guī)則黑褐色病斑，中間凹陷，潮濕時(shí)病斑表面生黑色霉層，影響水果的質(zhì)量和商品價(jià)值。2004年我國鴨梨曾因黑斑病而被停止出口美國和加拿大。多年來鏈格孢菌造成梨果病害更是有增不減，對新疆果農(nóng)的收入造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，世界上已報(bào)道的從梨果實(shí)上分離到的鏈格孢菌已命名的有9個(gè)種，中國報(bào)道的有5個(gè)種，分別是梨黑斑鏈格孢菌（A.gaisen）、鏈格孢菌（A.alternata）、細(xì)極鏈格孢（A.tenuissim）、鴨梨侵染鏈格孢（A.yaliinficiens）和侵染鏈格孢菌（A.infactoria）。其中，梨黑斑鏈格孢菌既能侵染梨葉片也能侵染果實(shí)，并產(chǎn)生寄主專化性毒素-AK毒素，是真正的梨黑斑病原菌［26］，梨黑斑鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌營養(yǎng)專化性不強(qiáng)，多生于植物的枯死部分或衰弱組織上，鴨梨侵染鏈格孢菌和侵染鏈格孢菌是美國學(xué)者R.G.Roberts從鴨梨果實(shí)上分離并命名的兩個(gè)新種［27-28］，李丙新等［29］、張志銘等［30］也從不同國家的梨中分離出以上五種鏈格孢菌。對其病害的研究主要是造成梨果黑斑病發(fā)生，對這五種菌的次生代謝產(chǎn)物并未做詳細(xì)的分離鑒定，五種病原主要寄主以梨果為主。

本研究分離并鑒定了梨黑斑鏈格孢菌（Alternaria gaisen）的6個(gè)次生代謝產(chǎn)物，得到6個(gè)毒素化合物，其中4個(gè)為毒素。根據(jù)萬佐璽等［31］研究鏈格孢菌是一種兼性寄生的真菌，在不同的寄主上產(chǎn)生的代謝毒素可能存在專化性和非專化性的區(qū)別，但是以不同的營養(yǎng)基質(zhì)作為發(fā)酵條件，分離鑒定梨黑斑鏈格孢菌的毒素成分均為非專化性毒素。分析梨黑斑鏈格孢菌的產(chǎn)毒情況，初步結(jié)果得到了梨黑斑鏈格孢菌盡管在不同營養(yǎng)基質(zhì)條件下，存在產(chǎn)毒含量的差異，但毒素種類并沒有顯著區(qū)別。是否與寄主及致病性有關(guān)，尚不清楚。