不同超聲輔助解凍方式對海鱸魚肌原纖維蛋白的影響

蔡路昀，許晴，曹愛玲

1(浙江大學 寧波研究院， 浙江 寧波，315100) 2(浙江大學 生物系統工程與食品科學學院，智能食品技術與裝備國家與地方聯合工程實驗室，浙江 杭州，310058)3(杭州海關，浙江 杭州，311208)

魚類等水產品作為促進人類健康的飲食組成部分變得越來越重要[1]。海鱸魚(Percafluviatilis)是我國重要的經濟魚類之一，廣泛分布于中國、日本、韓國等國家。《2019中國漁業統計年鑒》統計，2018年海水養殖魚類中鱸魚產量為16.58萬t，位居第二。海鱸魚味道鮮美，富含蛋白質、脂肪及微量元素等營養成分，并有一定的藥用價值，與養殖魚類相比具有巨大的經濟價值。但海鱸魚水分活性高，極易腐爛，目前主要依靠冷凍技術來保存。一般來說，短時間的冷凍可以保持魚類的感官特性和營養特性，但解凍會導致肌原纖維蛋白的變性、聚集和結構破壞等[2-3]。

解凍是冰晶融化的過程，但解凍的食品很難恢復到原來的新鮮狀態。因此，人們致力于研究新的解凍方法，更好地解決冷凍食品在解凍過程中的品質變化問題。但目前的解凍方法通常是緩慢和不均勻的，往往會引起魚肉品質的下降，如顏色變化、質量下降(解凍損失、蒸煮損失)、蛋白質變性和脂肪氧化等。因此，降低解凍對食品品質的影響是值得關注的問題。XIA等[4]研究發現豬肉質量變差的主要原因是蛋白質的氧化。蛋白質氧化的原因之一是通過非共價和共價分子間鍵形成蛋白質聚集體。一些研究表明，活性氧可以導致肉類蛋白質聚集和降解，使蛋白質的溶解度和功能降低[5]。蛋白質氧化的常見變化包括氨基酸的破壞，蛋白質的解折疊，斷裂和交聯以及蛋白質羰基的形成[6]。蛋白質氧化可能會導致食品品質下降，如汁液流失，風味變差和顏色變深。因此，人們致力于研究新的解凍方法，更好地減緩冷凍食品在解凍過程中蛋白質理化性質的變化。

鑒于上述原因，本實驗使用不同的解凍方式(超聲微波解凍，超聲遠紅外解凍，超聲歐姆解凍、超聲真空解凍，超聲解凍)，從蛋白質結構(拉曼光譜、紫外吸收光譜和內源熒光光譜)、蛋白質聚集程度(粒徑、Zeta電位和SDS-PAGE)和蛋白質氧化程度(總巰基含量和蛋白質溶解度)3個方面研究肌原纖維蛋白理化性質的變化，以找到能更好維持海鱸魚肌原纖維蛋白理化性質的解凍方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗原料為新鮮海鱸魚，質量為(1±0.1) kg，購于遼寧錦州當地的水產市場。自封袋(10 cm×7 cm)，購于廣州喬峰塑料制品有限公司。

Na2HPO4、Na2HPO4、CuSO4、酒石酸鈉等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠試劑盒，北京索萊寶科技有限公司;總巰基試劑盒，南京建成生物科技有限公司;18兆歐超純水，睿希化工處理廠。

1.2 材料與試劑

PS-60A超聲清洗機，東莞潔康超聲波設備有限公司；CX-1250L層析柜，嘉鵬科技有限公司；遠紅外管，元祥電器有限公司；Kl3705-B變頻電源，東莞市科聯電子有限公司；SHB-III水循環多功能真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；RC-4溫度記錄儀，江蘇省精創電氣股份有限公司；PL602-L電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；FJ300-SH標本數顯恒速高速分散均質機，上海右一儀器有限公司；Bioguge Stratos臺式高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Lab RAM HR Evolution氬離子激光拉曼光譜儀，HOPIBA公司；UV-2550紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；970CRT熒光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；Zetasizer Nano-ZS90納米粒徑電位分析儀，馬爾文儀器有限公司；Mini Protean 3凝膠電泳儀、GS-800拍照系統美國Bio-Rad公司；ZD-9556脫色搖床，常州市凱航儀器有限公司。

1.3 實驗方法

購買鮮活海鱸魚，0.5 h內運至實驗室。將魚敲死后剝皮取背部肉。魚片均切成5 cm×4 cm×2 cm小片，約30 g。用去離子水清洗后用保鮮膜包裹并放入自封袋，于-20 ℃冰箱內冷凍24 h。

1.3.1 解凍方式

超聲解凍：所有解凍方式的超聲波清洗機參數均設置為360 W、40 kHz[7]，每個處理組的魚肉均為30 g。耐熱容器中加入適量水淹沒魚肉，并放入超聲波清洗機中。魚塊中心溫度達到0 ℃時，解凍完成。解凍所需時間約為5 min。

超聲微波解凍：耐熱容器中加入適量水沒過魚肉，并放入超聲波清洗機中。將微波發射器對準耐熱容器。整個裝置置于層析柜中[7]。解凍耗時3 min左右。

超聲遠紅外解凍：耐熱容器中加入適量水沒過魚肉，并放入超聲波清洗機中，2兩根紅外管置于層析柜中夾層兩側的凹槽內[7]。解凍時長約為3 min。

超聲歐姆解凍：魚肉放入歐姆解凍的加熱槽中，并加水淹沒，然后放入超聲波清洗機中。同時開啟變頻電源和超聲清洗機進行解凍，耗時3 min左右。

超聲真空解凍：魚肉放入真空瓶中，加水淹沒，然后置于超聲波清洗機中[8]。同時打開真空泵和超聲清洗機進行解凍，4 min左右能完成解凍。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

通過改進年琳玉[9]的方法來提取海鱸魚的肌原纖維蛋白。將切碎的魚肉放入絞肉機內攪拌30 s，并稱取10 g碎魚肉。肌原纖維蛋白的整體提取工藝均維持在4 ℃。將碎魚肉加入到4倍體積預冷的磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH 7.5)，使用均質機均質60 s。然后將溶液在4 ℃下以6 000 r/min離心10 min，取沉淀。再次使用磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH 7.5)溶解沉淀，均質，離心，重復3次。最后，將沉淀加入到4倍體積的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，0.6 mol/L NaCl，pH 7.5)，再次均質、離心。上清液為肌原纖維蛋白。將肌原纖維蛋白在4 ℃冰箱中保存24 h。通過雙縮脲法測定蛋白濃度，并根據實驗要求調整合適的濃度。

1.3.3 拉曼光譜的測定

參考李秀霞等[10]的方法并稍作修改。將魚肉切成3 mm×3 mm×1 mm小片后，通過氬離子激光拉曼光譜儀進行測定。具體條件為：激發波長為532 nm，功率為120 mW，采集速率為120/(cm·min)，分辨率為2 cm-1，曝光時間為60 s，掃描范圍為400～3 600 cm-1。將樣品調整到3個不同的位置進行測量，并使用50倍透鏡顯微鏡觀察。

1.3.4 紫外吸收光譜的測定

參考ZHANG等[11]的方法進行測試，并稍作改動。用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，0.6 mol/L NaCl，pH 7.5)將肌纖維蛋白質量濃度稀釋至1 mg/mL，磷酸緩沖液作為空白。參數設定為掃描速度240 nm/min，間隔為1 nm，掃描波長范圍為190～400 nm。紫外二階導光譜可以形象地表征肌原纖維蛋白的結構變化。

1.3.5 內源熒光光譜的測定

參考李瑞平[12]的方法并稍作改動，對肌原纖維蛋白樣品進行內源熒光高速掃描檢測。將蛋白的最終質量濃度調整為0.1 mg/mL，并以磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，0.6 mol/L NaCl，pH 7.5)為空白。具體條件為激發波長295 nm，激發狹縫和發射狹縫均為10 nm，靈敏度為4，掃描范圍300～400 nm，每個處理組至少掃描3次。

1.3.6 粒徑的測定

參考BELICIU等[13]的方法并稍作修改。用稀釋至1 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液進行粒徑測定，可以看出蛋白的聚集程度。參數設定為溶劑為水，平衡時間為2 min，溫度為25 ℃，散射角為90°。蛋白溶液置于特定的比色皿，并放入測量池中，使用納米粒度分析儀進行測定，每組至少重復3次。

1.3.7 Zeta電位的測定

參考BELICIU等[13]的方法并稍作修改。樣品的最終測定質量濃度與粒徑相同，為1 mg/mL。將肌原纖維蛋白溶液倒入特定比色皿的1/3處，在25 ℃下使用納米粒度分析儀測定Zeta電位。

1.3.8 SDS-PAGE

將肌原纖維蛋白溶液稀釋至質量濃度為3 mg/mL，使用12%的分離凝膠和4%的濃縮凝膠。將6組肌原纖維蛋白溶液(10 μL)和上樣緩沖液以體積比1∶1混勻并按順序編號。Marker(6.5～200 kDa)作為參考，不添加上樣緩沖液。然后，在沸水中煮沸5 min，使蛋白質變性。將玻璃板置于充滿電極緩沖液的電泳裝置中。在電極緩沖液中取出梳狀體后加入混合物(20 μL)和Marker。施加80 V的電壓，到樣品形成一條直線后，將電壓升高至120 V。停止后，將凝膠放入搖床中，在塑料盆中加入100 mL的考馬斯亮藍染色劑，染色50 min。然后將凝膠轉移到另一個塑料盆中，使用混合液[V(無水乙醇)∶V(乙酸)∶V(超純水)=400∶100∶500]脫色過夜。最后，對凝膠進行拍照，得到電泳圖。

1.3.9 總巰基含量的測定

使用總巰基試劑盒測定總巰基的含量。每個樣品都需要對照管和測量管，但共用空白。將肌原纖維蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，在412 nm波長處測量吸光度值，每個樣品重復3次。巰基總量計算如公式(1)所示：

(1)

式中:A1,測量管的吸光度；A2,空白管的吸光度；A3,對照管的吸光度；V1,反應物的總體積,mL；ε,毫摩爾消光系數13.6/(mmol·cm)；C,蛋白質的含量；L,光徑(0.5 cm);V2,樣品的體積,mL。

1.3.10 溶解度的測定

參考姜晴晴等[14]的方法，并稍作修改。將5 mL肌原纖維蛋白溶液(5 mg/mL)放入離心管中，4 ℃，10 000×g離心10 min。取上清液測蛋白質濃度。溶解度計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.11 數據處理

使用SPSS 19.0的單因素方差分析(ANOVA)分析數據，然后進行Duncan多重范圍檢驗，數據表示為平均值±標準偏差(SD)，且P<0.05為顯著。使用OriginPro 9.0繪圖。每個處理組至少重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 拉曼光譜掃描

拉曼光譜是基于分子在基態電子態的離散振動躍遷，拉曼帶的波數和強度變化可以反映蛋白質的二級結構和局部環境的改變[15]。圖1-a為對400～3 600 cm-1的光譜進行了平滑處理、基線校正并將其歸一化得到的拉曼光譜圖。在1 600～1 700 cm-1，通過退卷曲、二階導和迭代擬合并通過計算峰面積比例分布，得到圖1-b。其中α-螺旋代表著組織良好的蛋白質結構(1 650～1 658 cm-1)；無規則卷曲代表著紊亂的蛋白質結構(1 660～1 665 cm-1)，以及β-折疊(1 665～1 680 cm-1)和β-轉角(1 680 cm-1附近)[16]。解凍后樣品的α-螺旋含量均下降，這可能是因為解凍過程中蛋白質展開，疏水基團暴露，氫鍵減弱，從而導致α-螺旋的斷裂，β-折疊，β-轉角和無規則卷曲的形成，β-折疊含量降低也可以歸因于疏水相互作用引起了蛋白質聚集。還可能是解凍處理使水進入蛋白質內部，從而導致蛋白質構象由折疊到展開[17]。由圖1-b可知，超聲解凍的蛋白質α-螺旋的含量約為33.95%，低于新鮮樣品和其他解凍方法；無規則卷曲的含量約為25.25%，高于所有處理組，這意味著超聲解凍維持蛋白質二級結構的能力最差。超聲微波解凍和超聲真空解凍的α-螺旋的含量和新鮮樣品最接近。CAI等[7]發現美國紅魚在超聲微波解凍后，α-螺旋轉化為無規卷曲的含量較少，顯示出更穩定的蛋白質結構，和本文的結果一致。

a-拉曼光譜；b-二級結構分布比例圖1 不同解凍方式對肌原纖維蛋白拉曼光譜二級結構分布比例的影響Fig.1 Effects of different thawing methods on Raman spectroscopy and different distribution proportions of secondary structure

2.2 紫外吸收光譜

利用紫外吸收光譜分析蛋白質的光譜躍遷和芳香氨基酸的微環境變化[18]。紫外二階導數光譜是一種從光譜中提取信息的方法，已用于描述近紫外區域中復雜的蛋白質光譜轉變，以及芳香族氨基酸殘基的作用。由圖2可知，有2個正吸收峰(287 nm處為色氨酸和酪氨酸共同作用的吸收峰，296 nm處為色氨酸單獨作用的吸收峰)和2個負吸收峰(279 nm和293 nm處)。相較于新鮮樣品，所有解凍后樣品在287 nm處的波峰出現不同程度的紅移(向長波方向移動)；在296 nm處的波峰出現不同程度的藍移(向短波方向移動)，這說明蛋白質變性，色氨酸極性環境增大，表面疏水性增加，蛋白質發生聚集。“a”為第一個吸收峰的波峰與波谷的距離，“b”為第二個吸收峰的波峰與波谷的距離。“r”值為“a”與“b”的比值，可以用來反映酪氨酸微環境的變化。酪氨酸的“r”值隨著溶劑極性的減小而減小，而色氨酸的“r”值幾乎與溶劑極性無關。較低的“r”值說明酪氨酸微環境的極性降低[19]，較高的“r”值意味著蛋白質結構的解聚和展開過程中，埋在肌原纖維蛋白中的酪氨酸殘基逐漸暴露于表面，并發生向疏水區域移動和三維位置變化的現象[20]。超聲歐姆解凍和超聲真空解凍的“r”值小于新鮮樣品，超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍和超聲解凍的“r”值大于新鮮樣品。與新鮮樣品的“r”值相比，超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍、超聲歐姆解凍、超聲解凍沒有顯著性差異(P>0.05)。其中，超聲微波解凍的“r”值與新鮮樣品的最接近，這說明超聲微波解凍對蛋白質的結構影響較小，可以更好地維持肌原纖維蛋白原有的特性。

圖2 不同解凍方式對肌原纖維蛋白紫外二階導光譜的影響Fig.2 Effects of different thawing methods on ultraviolet second derivative spectra of myofibrillar protein

2.3 內源熒光光譜

內源熒光光譜法是一種追蹤蛋白質三級結構轉變的技術[21]。色氨酸是一種必需氨基酸，通常包含在許多基于蛋白質的食品中。色氨酸埋藏在蛋白質的核心，對結構轉變過程中微環境的極性特別敏感。當其他分子與蛋白質相互作用時，蛋白質構象也可能受到影響，色氨酸的熒光強度發生變化。最大熒光峰位的紅移表明芳香氨基酸的極性環境增加，色氨酸處于親水環境中，蛋白質結構展開[22]；最大熒光峰位的藍移表明蛋白聚集，色氨酸進入更疏水的環境[23]。如圖3所示，新鮮樣品的色氨酸的最大發射波長位于335 nm附近。與新鮮樣品相比，超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍、超聲解凍的最大熒光峰位發生藍移，超聲歐姆解凍和超聲真空解凍發生紅移，但所有處理組間的最大熒光峰位沒有顯著性差異(P>0.05)。新鮮樣品的熒光強度明顯高于解凍后的樣品，熒光強度的降低是由色氨酸的暴露和氧化造成的[24]，也有可能是部分蛋白質的解聚導致從內部到表面的色氨酸殘基增加，從而增強了色氨酸殘基周圍水分子的穿透，使色氨酸殘基暴露在更極性的微環境中。超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍的熒光強度和新鮮樣品相比無顯著性差異(P>0.05)，這說明超聲微波解凍和超聲遠紅外解凍處理的樣品有效地避免了蛋白質的結構破壞和變性，且超聲微波解凍的熒光強度與新鮮樣品最接近。超聲歐姆解凍、超聲真空解凍、超聲解凍的熒光強度顯著低于新鮮樣品(P<0.05)，說明蛋白質的結構被破壞。其中，超聲解凍的蛋白質結構的受損程度比聯合解凍方式更嚴重，這可能是因為解凍過程中氨基酸暴露在空氣中的時間較長，氧化程度更高，從而導致熒光強度顯著降低。CAI等[8]研究超聲解凍、真空解凍、微波解凍、超聲真空解凍和微波真空解凍對真鯛品質的影響，發現聯合處理的樣品具有更少的蛋白質損傷。

圖3 不同解凍方式對肌原纖維蛋白內源熒光光譜的影響Fig.3 Effects of different thawing methods on intrinsic fluorescence scanning of myofibrillar protein

2.4 粒徑

粒徑可以用來表征肌原纖維蛋白的聚集程度。解凍過程中會產生熱量，熱誘導的肌原纖維蛋白聚集分為2個階段：(1)單個蛋白分子的變性和展開，導致肌絲解離形成可溶性寡聚物；(2)在后續階段中，連續加熱后，未折疊的亞基可能會重新排列并彼此偶聯，形成大的聚集體和化合物簇[25]。所有樣品的粒徑分布和平均直徑如圖4所示。在1 000 nm左右，只觀察到新鮮樣品、超聲遠紅外解凍和超聲歐姆解凍的一個峰，說明它們的粒徑分布比較均勻。而超聲真空解凍和超聲解凍的新峰出現在約100 nm處，這個現象可以用肌原纖維蛋白聚集的第一階段來解釋；超聲微波解凍的新峰出現在約10 000 nm處，這可能是因為肌原纖維蛋白發生了聚集的第二階段。與新鮮樣品相比，超聲微波解凍和超聲歐姆解凍的峰在1 000 nm處略微向左移動，顆粒尺寸分布更寬，這表明蛋白質的完整性被破壞，顆粒尺寸減小。同時，在1 000 nm處觀察到超聲遠紅外解凍、超聲真空解凍和超聲解凍的峰值向右偏移。這可能是由于蛋白質變性從而導致肌原纖維蛋白的三級和四級結構的聚集[26]。由圖4可知，超聲微波解凍的有效粒徑最小，超聲解凍的有效粒徑最大。相較于新鮮樣品，超聲遠紅外解凍、超聲歐姆解凍、超聲真空解凍和超聲解凍的蛋白質有效粒徑增大。蛋白質的有效粒徑的增大可能是由于蛋白質的氧化作用，從而使蛋白質分子形成二硫鍵并發生聚集。SUN等[27]發現，除了熱相互作用和蛋白降解外，巰基和二硫鍵的轉換可能導致肌纖維蛋白的有效粒徑發生變化。FU等[28]研究出蛋白質的疏水基團氧化后暴露，通過疏水相互作用使蛋白質聚集，使肌纖維蛋白的有效粒徑增大。新鮮樣品和解凍后樣品的有效粒徑間沒有顯著性差異(P>0.05)。因此，解凍后的所有肌原纖維蛋白均能保持穩定的結構。其中，超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍和超聲歐姆解凍的有效粒徑與新鮮樣品最接近。結果表明，超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍和超聲歐姆解凍的肌原纖維蛋白能夠在解凍過程中保持相對穩定的狀態。

圖4 不同解凍方式對肌原纖維蛋白粒徑分布的影響Fig.4 Effects of different thawing methods on the particle size distribution of myofibrillar protein

2.5 Zeta電位

Zeta電位是影響分散體系穩定性的基本參數之一，是描述顆粒之間排斥或吸引的強度的參數。可以表示蛋白質表面的有效電荷，反映著蛋白質的分散和聚集[29]。由圖5可知，所有的Zeta電位值都是負數。用|ξ|來表示Zeta電位的絕對值。靜電排斥可以降低蛋白質分子之間聚集的可能性，從而維持系統的穩定性。較高的|ξ|意味著同性電荷的靜電排斥增強，使蛋白質溶液更穩定，從而削弱了蛋白質之間的相互作用，形成的分子或分散的顆粒較小[30]。反之，較低的|ξ|，靜電排斥低，蛋白質容易發生聚合。超聲微波解凍，超聲真空解凍和超聲解凍的|ξ|低于新鮮樣品，這表明經超聲微波解凍、超聲真空解凍、超聲解凍后，蛋白質有一定的聚集，穩定性略有下降。超聲遠紅外解凍的|ξ|最大，并且超聲遠紅外解凍和超聲真空解凍的|ξ|高于新鮮樣品，這可能是因為在超聲遠紅外解凍和超聲真空解凍的復雜解凍過程中蛋白質發生了解聚。解凍后樣品的Zeta電位值出現高于或低于新鮮樣品的現象，這可以歸因于熱誘導的肌原纖維蛋白分別處于聚集的2個階段。與新鮮樣品相比，所有的解凍處理的Zeta電位無顯著性差異(P>0.05)，保留了肌原纖維蛋白原有的狀態，與上述粒徑的結果一致。這說明所有的解凍方法都能有效地防止蛋白氧化和聚集，得到相對穩定的蛋白溶液體系。

圖5 不同解凍方式對肌原纖維蛋白電位的影響Fig.5 Effects of different thawing methods on Zeta potential of myofibrillar protein注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 SDS-PAGE

圖6中為6種不同處理方式的電泳圖譜。肌原纖維蛋白的主要條帶有肌球蛋白重鏈(200 kDa)、肌動蛋白(48 kDa)、原肌球蛋白(35 kDa)和肌球蛋白輕鏈(10～30 kDa)。可以觀察到，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的條帶較寬，說明肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白和肌動蛋白組成。其中，肌球蛋白重鏈是分析魚肉的理化性質有關的最重要的蛋白質[31]。新鮮樣品的肌球蛋白重鏈條帶顏色最深且寬，解凍處理后的條帶顏色較淺。這可能是由于在解凍過程中，蛋白質在極端條件下的交聯受到限制，或者是肌球蛋白重鏈氧化，二硫鍵和羰基的形成導致蛋白質降解，溶解度降低[32]。超聲解凍的肌球蛋白重鏈條帶顏色最淺，蛋白聚合物降解程度最嚴重，這可能是因為單獨超聲波產生的空化對肌原纖維蛋白影響更大。超聲微波解凍的電泳條帶與新鮮樣品最接近，可能是因為較快的解凍速度抑制肌球蛋白重鏈濃度的降低并減少蛋白質降解，較好地保持了肌原纖維蛋白原有的理化性質。

圖6 不同解凍方式的肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 The SDS-PAGE diagram of myofibrillar protein of different thawing methods

2.7 總巰基含量

總巰基含量會影響蛋白質的功能特性，可以用來表示蛋白質的氧化程度[33]。總巰基含量是指蛋白質分子的所有巰基，包括暴露在表面的(反應性巰基)和埋在蛋白質中的。肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白和肌動蛋白組成，包含了許多易受氧自由基影響的巰基基團，并容易轉化為分子內和分子間二硫鍵。巰基的減少和二硫鍵的形成是肌肉蛋白聚集結構形成的關鍵。但是，ZHANG等[34]指出在強氧化條件下，巰基的損失與二硫鍵的生成并不完全對應。解凍過程中會產生熱量并發生擠壓，這也可能導致蛋白質解折疊并影響二硫鍵和巰基的含量[20]。二硫鍵在蛋白質聚合中起著重要的作用，但過多的二硫鍵會阻礙反應官能團的有序相互作用，導致凝膠化能力下降[32]。由圖7可知，新鮮樣品的總巰基含量高于解凍后的樣品。這是由于在解凍過程中，蛋白質展開，巰基暴露于表面，被氧化成二硫鍵[35]。超聲解凍的總巰基含量最低，和新鮮樣品有顯著性差異(P<0.05)。超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍、超聲歐姆解凍和超聲真空解凍的總巰基含量與新鮮樣品無顯著性差異(P>0.05)，這說明這些解凍方法的蛋白氧化程度較低。其中，超聲微波解凍和超聲遠紅外解凍的總巰基含量和新鮮樣品更接近。因此，超聲微波解凍和超聲遠紅外解凍能有效地阻止蛋白質的氧化。李慢[36]發現超聲解凍的蝦肉蛋白質巰基含量較高、氧化程度較低，但本文中所有超聲輔助解凍處理的均高于單獨的超聲解凍，說明超聲輔助解凍對海鱸魚肌原纖維蛋白的功能特性影響較小。

圖7 不同解凍方式對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig.7 Effects of different thawing methods on the content of total sulfhydryl (SH) groups of myofibrillar protein

2.8 溶解度

蛋白質的溶解度是反映蛋白質變性程度的常見指標之一[37]。溶解度也是蛋白質功能性質的重要表現，蛋白質與水分子通過肽鍵(偶極-偶極或氫鍵相互作用)或氨基酸側鏈(內化、極性甚至非極性基團相互作用)相互作用[11]，影響了蛋白質的保水性、發泡性、乳化性等。由圖8可知，新鮮樣品的蛋白溶解度顯著高于解凍樣品(P<0.05)。蛋白質氧化過程中，形成了二硫鍵、二酪氨酸和羰基，二硫化物發生交聯，疏水基團的結構疏松暴露出來，蛋白質變性，導致溶解度降低，這與上述巰基總含量的結果一致。肌原纖維蛋白在解凍過程中會經歷構型變化，這受到疏水性增加的支持，對熱穩定性的影響較小。超聲解凍的蛋白溶解度最低，說明大量蛋白質通過疏水作用形成聚集體，導致蛋白質高度變性。超聲微波解凍、超聲遠紅外解凍、超聲歐姆解凍和超聲解凍的溶解度沒有顯著性差異(P>0.05)。超聲真空解凍的溶解度明顯高于其他解凍方法(P<0.05)，這可能是由于超聲真空解凍是2種非熱解凍方式的結合，蛋白氧化程度較低。

圖8 不同解凍方式對肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.8 Effects of different thawing methods on the solubility of myofibrillar protein

3 結論

不同超聲輔助解凍方式對肌原纖維蛋白有著不同的影響。實驗結果表明，超聲輔助解凍方式比單獨的超聲解凍更有效的維持蛋白質原有的特性。超聲微波解凍和超聲真空解凍的α-螺旋的含量與新鮮樣品接近，維持蛋白質二級結構的能力較強。超聲微波解凍樣品的“r”值和熒光強度與新鮮樣品最接近，有效地避免了蛋白質結構的破壞。所有處理組的蛋白粒徑、Zeta電位無顯著性差異(P<0.05)，蛋白質未發生明顯聚集。但凝膠電泳的結果表明超聲解凍的蛋白質嚴重降解。超聲微波解凍和超聲遠紅外解凍樣品的總巰基含量與新鮮樣品無顯著性差異(P>0.05)，氧化程度較低。綜上所述，超聲微波解凍是一種能較好地維持海鱸魚蛋白結構、防止蛋白聚集、抑制蛋白氧化的解凍方法。