兩株拮抗芽孢桿菌對靈武長棗采后致腐真菌的抑菌作用

任苗苗，閆思遠，李嘉泓，杜娟，馬玲，顧沛雯

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川， 750021)

靈武長棗以鮮食為主，皮薄、多汁，鮮銷期短，采后儲運不當，腐敗現象嚴重。已有研究發現，交鏈格孢(Alternariaalternata)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、黑根霉(Rhizopusstolonifer)、皮落青霉(Penicilliumcrustosum)和微孢毛霉(Mucormicrosporus)等[1]病原真菌侵染是導致靈武長棗采后腐爛的重要因素。目前，靈武長棗采后保鮮多以低溫冷藏和化學殺菌劑為主。但低溫冷藏成本較高，能耗高，溫度調控不當易引發果實冷害，果品質量不穩定[2]；化學殺菌劑保鮮因存在果品污染、農藥殘留超標、健康威脅及增加病原菌的抗藥性等問題也備受消費者抵制[3]。因此，尋求安全、有效的靈武長棗采后防腐保鮮新技術迫在眉睫。

芽孢桿菌(Bacillus)是一類好氧性革蘭氏陽性細菌，其分布廣泛、生長快、抗逆性強、存活率高、是重要的生防資源[4-5]。此外，還能分泌多種抗生物質抑制病原菌，提高植株的抗病性，促進植物的生長[6-7]。近年來，利用芽孢桿菌作為一種綠色果蔬保鮮劑逐漸成為一種趨勢[8]，大量研究表明，芽孢桿菌可以有效抑制桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)[9]、梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)[10]、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)[11]及番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)[12]等多種果蔬采后病原真菌，但有關利用芽孢桿菌來防治靈武長棗采后致腐真菌的研究尚未見報道。

本研究以實驗室前期從寧夏溫棚土壤中分離的2株拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2為材料，采用形態學、生理生化和分子生物學相結合的方法，確定2株拮抗芽孢桿菌的分類地位，并通過皿內對峙培養和離體保鮮試驗探究2株拮抗芽孢桿菌對靈武長棗采后致腐真菌的抑菌作用和對靈武長棗的保鮮效果，以此評估拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2在靈武長棗生產保鮮中的應用價值，以期為靈武長棗采后致腐病害的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

供試拮抗芽孢桿菌和化學殺菌劑：拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2，分離自寧夏溫棚土壤中，經純化后，保存于寧夏大學植物病理實驗室；50%多菌靈，購于江蘇三山農藥有限公司。

供試致腐真菌：交鏈格孢A.alternata和灰葡萄孢B.cinerea純化菌種，從采后腐爛的靈武長棗上分離，經純化后，保存于寧夏大學植物病理實驗室。

供試果品：2019年9月～11月，在寧夏靈武市大泉林場采摘大小一致、無病蟲害及機械損傷的8成熟靈武長棗(紅色面積占棗果總面積的1/2～2/3)用于保鮮試驗。

1.1.2 儀器與設備

Olympus BX53正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Bio-Rad T100梯度聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀，美國Bio-Rad公司；Centrifuge 5804R冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；Sciencetool R300真空抽濾泵，美國Sciencetool公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒、LB液/固體培養基，北京天根生化科技有限公司；革蘭氏染色液，北京索萊寶科技有限公司；10×EasyTaqbuffe、dNTPs、EasyTaqDNA Polymerase，北京全式金生物技術有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基，北京陸橋技術股份有限公司；營養瓊脂(nutrient agar，NA)培養基，青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 引物

采用細菌16S rDNA基因組序列設計引物，引物序列為27F/1492R(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)/(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，上海生工生物有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢桿菌菌株鑒定

1.2.1.1 拮抗芽孢桿菌形態學和生理生化指標

形態特征觀察及生理生化試驗參照《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠2001版)。具體方法為取純化好的拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2在NA培養基平板上劃線，30 ℃培養12 h，觀察菌落形狀、顏色和透明度等。繼續培養12 h后，挑取菌株單菌落進行革蘭氏染色，在油鏡1 000倍下觀察菌體形態。

采用東秀珠等[13]的方法，測定拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2的最適生長溫度、最適PH值、糖(醇)類發酵試驗、氧化酶反應、接觸酶反應、耐鹽性試驗、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠液化、M·R試驗、V-P測定、檸檬酸鹽利用和吲哚試驗等生理生化指標。

1.2.1.2 拮抗芽孢桿菌分子生物學鑒定

(1)拮抗芽孢桿菌DNA提取

將純化好的拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2在NA平板上活化培養16 h，用滅菌牙簽挑取單菌落置于裝有3 mL LB液體培養基的滅菌試管中，30 ℃，200 r/min培養24 h，獲得細菌培養液。參照TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取菌株YBGJ1和YBGJ2的總DNA。

(2)PCR反應體系及擴增條件

PCR反應體系(25 μL)：EasyTaqbuffer (10×) 2.5 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL、 27F/1492R引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板1 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL，補充ddH2O至25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環，72 ℃保溫10 min，4 ℃保藏。擴增產物于1.0%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳中檢測。PCR擴增產物回收后送至上海生工生物有限公司進行測序。

(3)系統發育樹分析

將拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2的測序所得序列與GenBank數據庫中近緣種的16S rDNA基因序列進行同源性比對，利用DNAMAN 6.0.3.48軟件中鄰接法(Neighbor-Joining methods，NJ)構建系統發育樹。

1.2.2 拮抗芽孢桿菌培養濾液的抑菌活性

1.2.2.1 培養濾液的制備

挑取預先培養18 h的拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2的單菌落，置于裝有150 mL滅菌LB液體培養基的三角瓶中，30 ℃，200 r/min培養3 d，將培養好的發酵液(3.2×107CFU/mL)于6 000 r/min離心20 min，上清液經0.45 μm的微孔濾膜過濾，獲得培養濾液，4 ℃保存備用。

1.2.2.2 培養濾液對致腐真菌菌絲生長的抑制作用

采用菌絲生長速率法進行抑菌測定[14]。將拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2的培養濾液與冷卻至50 ℃左右的滅菌LB固體培養基混勻，分別配制成培養濾液體積分數為5%、10%、15%、20%、25%和30%的LB平板，無菌水處理為對照，凝固后，在平板中央放置1個直徑6 mm的致腐真菌菌餅。每組處理重復3次，置于28 ℃霉菌培養箱中培養，待對照致腐真菌菌絲滿皿后，測量對照和各處理的致腐真菌半徑，計算菌絲抑制率。

(1)

式中：Rc，對照致腐真菌半徑；Rp，各處理致腐真菌半徑。

1.2.2.3 培養濾液對致腐真菌孢子萌發的抑制作用

致腐真菌孢子懸浮液的制備：將致腐真菌菌株接種至PDA培養基上，25 ℃黑暗培養5 d，進行菌種活化。加入5 mL無菌水沖洗PDA培養平板，收集菌絲和孢子混液，用雙層無菌紗布過濾，除去菌絲，得到致腐真菌孢子懸浮液。用血球板計數法，將致腐真菌孢子懸浮液稀釋至1×105CFU/mL，接種備用。

致腐真菌孢子抑制率測定：將拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2的培養濾液分別配制成體積分數為20%、40%、60%、80%和100%備用。將配制好的不同體積分數的拮抗芽孢桿菌培養濾液與致腐真菌孢子懸浮液按體積比1∶1混合，使拮抗芽孢桿菌菌株培養濾液的最終體積分數分別為10%、20%、30%、40%和50%，設無菌水和致腐真菌孢子懸浮液混合為對照，每組處理重復3次，30 ℃黑暗培養8 h，每個重復在光學顯微鏡(400倍)下隨機觀察5個視野，每個視野下隨機觀察20個孢子，統計孢子的萌發率和孢子萌發抑制率,計算如公式(2)所示：

孢子萌發抑制率/%=

(2)

1.2.3 離體保鮮試驗

將健康的靈武長棗用無菌水輕微沖洗2次，祛除表面灰塵后置于吸水紙上晾干。分別用無菌水、50%(體積分數)多菌靈500倍液、拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液(體積分數10%、20%、30%、40%、50%)浸果1 min，自然晾干，裝入20 μm厚保鮮袋中，預先在保鮮袋兩側均勻扎10個針孔(失去氣調作用)，每袋12顆果，共處理48袋，置于15 ℃冷藏柜中貯藏，每組處理重復4次。每隔5 d觀察腐爛情況并統計腐爛率。參照張淑萍等[15]的方法統計靈武長棗貯藏期間腐爛率，果面出現直徑>0.3 cm的病斑視為爛果，此類果占統計果實總數的百分比計為腐爛率，以20%腐爛率為臨界點，判定靈武長棗失去商品價值。

2 結果與分析

2.1 拮抗芽孢桿菌菌株鑒定

2.1.1 形態學和生理生化指標

拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2在NA平板上的菌落形態如圖1所示。結合菌株形態學(表1)和生理生化特征(表2)，參考《常見細菌系統鑒定手冊》，初步將菌株YBGJ1和YBGJ2鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

a-菌株YBGJ1菌落形態；b-菌株YBGJ2菌落形態；c-菌落YBGJ1菌體形態；d-菌株YBGJ2菌體形態圖1 菌株YBGJ1和YBGJ2菌落及菌體形態(1 000×)Fig.1 Observation of colonies and morphology of strains YBGJ1 and YBGJ2

表1 菌株YBGJ1和YBGJ2在NA培養基上的菌落特征

表2 菌株YBGJ1和YBGJ2的生理生化特征

2.1.2 分子生物學鑒定

以拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2的總DNA為模板，采用細菌16S rDNA序列通用引物(27F/1492R)進行PCR擴增，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后獲得2條1 400 bp左右的亮帶。將2菌株的測序結果與NCBI中近緣種的16S rDNA基因序列進行同源性比對，構建系統發育樹(圖2)。按16S rDNA基因序列相似性>97%的菌株歸于同一個種的規則，菌株YBGJ1(登錄號：MN727140)與枯草芽孢桿菌(B.subtilis) MML5328(登錄號:MF688046)的親緣關系最近，同源率為100%，鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)；菌株YBGJ2(登錄號：MN727139)與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) TL4(登錄號:KY129662)的親緣關系最近，同源率為100%，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

圖2 菌株YBGJ1和YBGJ2 基于16S rRNA基因序列建立的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains YBGJ1 and YBGJ2 based on 16S rRNA gene sequence

2.2 拮抗芽孢桿菌培養濾液對致腐真菌的抑制作用

2.2.1 對致腐真菌菌絲生長的抑制作用

由表3可知，拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2的培養濾液對交鏈格孢和灰葡萄孢菌絲生長都具有較好的抑制作用。其中菌株YBGJ1培養濾液體積分數為25%和30%時，對灰葡萄孢的菌絲抑制率均高達95.83%；菌株YBGJ2培養濾液體積分數為20%時，對灰葡萄孢菌絲的抑制率高達95.79%；菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對交鏈格孢菌絲的抑制效果明顯低于灰葡萄孢，菌株YBGJ1培養濾液體積分數為10%時，菌絲抑制率最高達79.46%；菌株YBGJ2培養濾液體積分數為15%時，對交鏈格孢菌絲抑制率最高達78.56%。觀察平板上致腐真菌菌絲生長情況，發現與對照相比菌絲體長勢明顯減弱(圖3-a和圖3-b)，菌落稀疏變薄，甚至停止生長(圖3-c和圖3-d)。

表3 菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對致腐真菌菌絲生長的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of culture filtrate of strains YBGJ1 and YBGJ2 on mycelial growth of rotogenic fungi

a-菌株YBGJ1培養濾液對峙交鏈格孢；b-菌株YBGJ2培養濾液對峙交鏈格孢；c-菌株YBGJ1培養濾液對峙灰葡萄孢；d-菌株YBGJ2培養濾液對峙灰葡萄孢圖3 菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對致腐真菌菌絲生長的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of culture filtrate of strains YBGJ1 and YBGJ2 on mycelial growth of rotogenic fungi

2.2.2 對致腐真菌孢子萌發的影響

由表4可知，拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對交鏈格孢和灰葡萄孢的分生孢子萌發均有抑制作用。隨著培養濾液體積分數的增加，對致腐真菌的孢子萌發抑制率增強。菌株YBGJ1 和YBGJ2培養濾液體積分數為50%時，對灰葡萄孢的孢子萌發抑制率分別高達85.00%和91.09%，對交鏈格孢的孢子萌發抑制率分別為80.98%和84.38%；其次，2株芽孢桿菌培養濾液體積分數為40%時，對致腐真菌的孢子萌發抑制率也均達到70.00%以上，由此可以推斷，拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液中含有某種抑菌活性物質能顯著抑制致腐真菌的生長。

表4 菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對致腐真菌孢子萌發的抑制作用 單位：%

2.3 離體保鮮試驗

由表5和圖4離體保鮮試驗結果可知，靈武長棗貯藏10 d時，無菌水對照腐爛率達20.84%，已失去商品價值，化學藥劑多菌靈、體積分數為30%的YBGJ1培養濾液、體積分數為10%和20%的YBGJ2培養濾液處理的長棗腐爛率均為0。當貯藏30 d時，無菌水對照已全部腐爛，長棗果肉變褐，腐爛現象嚴重，經體積分數為30%的YBGJ1培養濾液和體積分數為10%的YBGJ2培養濾液處理的長棗達到了貯藏臨界點，果面出現腐敗斑，果肉由綠變褐，腐爛率分別為29.17%和22.92%，與無菌水對照相比腐爛率分別降低了70.83%和77.08%，延長貨架期15～20 d，保鮮效果與化學藥劑多菌靈相當。說明在15 ℃貯藏條件下，體積分數為30%的菌株YBGJ1培養濾液和體積分數為10%的菌株YBGJ2培養濾液對靈武長棗具有顯著的保鮮效果。

表5 菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對靈武長棗采后保鮮效果 單位：%

a-無菌水的保鮮效果；b-30% YBGJ1的保鮮效果；c-10% YBGJ1的保鮮效果；d-多菌靈的保鮮效果圖4 菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對靈武長棗采后保鮮效果Fig.4 Effect of culture filtrate of strains YBGJ1 and YBGJ2 on postharvest preservation of Ziziphus jujube cv. Lingwu changzao

3 結論與討論

芽孢桿菌可通過競爭作用、拮抗作用、溶菌作用等方式發揮防病功效，具有防治果蔬采后病害的優勢[6]。拮抗菌株YBGJ1和YBGJ2經形態學、生理生化和分子生物學鑒定，證明是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。通過皿內對峙培養發現，拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液對交鏈格孢(A.alternata)和灰葡萄孢(B.cinerea)的菌絲生長和孢子萌發都具有明顯的抑制作用，說明2種菌株培養濾液中含有某種抑菌活性物質能顯著抑制致腐真菌的生長。LI等[16]從枯草芽孢桿菌(B.subtilis) B29培養液中分離到抗真菌蛋白B29I，其對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)的菌絲生長和孢子萌發具有較強的抑制作用；向亞萍等[17]從解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) B1619的發酵液上清中分離出3 種脂肽類抗生素，并證實bacillomycin L、fengycins和surfactins都對尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)具有一定的抑制作用。但拮抗芽孢桿菌菌株YBGJ1和YBGJ2培養濾液中是何種活性成分對靈武長棗致腐病原真菌發揮抑菌功效，其是否具有安全性等還尚未明確，仍需進一步研究。

微生物保鮮劑的使用劑量與其保鮮效果有直接關系[18]。陳成等[19]發現采用中濃度(3.5×105CFU/mL)枯草芽孢桿菌(B.subtilis) ME2菌懸液處理桑椹鮮果的保鮮效果高于低濃度(3.5×103CFU/mL)和高濃度(3.5×107CFU/mL)。胡麗杰等[20]將輪狀鐮刀菌(Fusariumnematophilum) NQ8GII4培養濾液體積分數設置在10%～40%可顯著降低枸杞果炭疽病的發病率。本研究在前期離體保鮮預試驗中發現，選用菌株YBGJ1和YBGJ2的培養濾液在體積分數10%～40%時對靈武長棗保鮮效果較好，其中體積分數為30%的菌株YBGJ1培養濾液和體積分數為10%的菌株YBGJ2培養濾液保鮮效果最好。培養濾液的體積分數過低或過高時，保鮮效果均不理想，可能是由于體積分數過低時，培養濾液中抑菌成分含量較少，不利于抑制病原菌，而培養濾液體積分數過高時，芽孢桿菌會吸收長棗表面的養分，與宿主處于敵對狀態[20]，故不利于靈武長棗的保鮮。

本研究發現枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)可以作為極具前景的果蔬微生物源保鮮劑研發的出發菌種，有望開發成天然、無害、環保的生物制劑。但目前有關枯草芽孢桿菌(B.subtilis) YBGJ1和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) YBGJ2在靈武長棗上的防腐保鮮機理尚未明確，防腐保鮮過程中又受長棗本身生理特性及儲藏環境等諸多因素影響，故作為新型果蔬保鮮制劑開發應用還有待深入研究。