高品質牦牛發酵乳的成熟特性

沈興旺，李婉麒，趙創謙，崔鑫儒，陳紫穎，湯柳茜，張匯，熊智強，艾連中，夏永軍

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

牦牛常年生活在海撥3 000 m以上的高寒地帶，采食天然牧草，當地空氣、水源、草場均未受污染，因此所產牛奶是純天然的綠色食品，被譽為“天然綠色濃縮奶”[1]。發酵乳是由鮮乳經乳酸菌發酵而成，不僅改善了營養品質，還產生了生物活性物質，具有較好的益生功能[2]。牦牛發酵乳有益于消化，可以治療輕微腹瀉，還有抑菌、鎮靜的功能，其營養價值高于普通牛奶，是一款潛在的保健飲料。過去牦牛乳產品加工標準缺失，牦牛酸奶的加工一直停留在初級階段[3]，在實際生產、運輸等環節，牦牛發酵乳普遍存在因為凝膠脆弱導致組織狀態破壞及乳清析出等問題，嚴重影響了牦牛發酵乳的品質。

益生菌可改善體內微生物菌群平衡，對宿主健康產生積極作用。發酵乳被認為是將益生菌傳遞到人體內的最理想載體，發酵乳添加益生菌后，他們之間保健作用和營養價值互相交織在一起，可完美結合起來。本研究所采用的益生菌菌種為實驗室自行篩選得到，并且具有優良的生理活性，LactobacillusplantarumAR501具有優良的抗氧化活性，能夠顯著緩解煎炸油引起的肝臟氧化應激損傷[4-5]；LactobacillusplantarumAR495具有緩解骨質疏松功能，并具有較好的胞多糖合成能力；LactobacillussalivariusAR809具有防齲齒，緩解細菌性咽炎的活性，并具有較好的胞多糖合成能力[6]。本研究主要探討添加益生菌株對發酵乳發酵過程中理化性質、質構、流變學特性及感官品質的影響[7]，為開展高品質牦牛發酵乳的研究和提升青藏高原牦牛產業發展提供一定理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳，青海高原之寶牦牛乳業有限公司；植物乳桿菌L.plantarumAR501(保藏編號CGMCC 13910)、植物乳桿菌L.plantarumAR495(保藏編號CGMCC 14004)、唾液乳桿菌L.salivariusAR809(保藏編號CGMCC 17206)，-80 ℃凍存管保存；普通酸奶發酵劑YO-MIX 883(保加利亞乳桿菌Lactobacillusbulgaricus、嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophiles)，丹尼斯克(中國)有限公司；改良MRS培養基(g/L)：牛肉浸出粉10、酪蛋白胨10、酵母浸出粉5、葡萄糖20、三水乙酸鈉8.3、檸檬酸氫二胺2、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·H2O 0.25、吐溫-80 1；ZnSO4、NaNO3、K2HPO4·3H2O、ZnSO4、CaCl2、HCl、三氯乙酸、NaCl、H2SO4、磷鎢酸、無水Na2SO4、KOH、NH4HCO3(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；白砂糖，南京甘汁園糖業。

1.2 儀器與設備

3-18K型冷凍離心機, 德國Sigma公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化；KBF240型恒溫恒濕培養箱，德國Binder公司；PB-10型pH計，瑞士梅特勒-托利多公司；FOSS 8400全自動凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司；WNB7-45型快速升溫水浴鍋，德國Memmert有限公司；PL2002型電子天平，瑞士Metrler Toledo公司；LDZF-30KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安；TA.XTPlus物性測試儀，英國Stable Micro System公司；DHR-3旋轉流變儀，美國TA儀器；APV100高壓均質機，丹麥APV 公司；BCD-278TAJ型冰箱，海爾集團公司。

1.3 試驗方法

菌株培養：將菌株從-80 ℃取出，菌種繼代于MRS液體培養基中培養生長，接種量為1%。

酸奶制備：新鮮牛乳，加入質量分數為7%的白砂糖，42 ℃攪拌水合，均質機均質，巴氏殺菌，冷卻至42 ℃，接種量為2%，42 ℃培養，4 ℃冷藏，破乳。

酸度測定：采用滴定酸度法，以吉爾涅爾度(°T)表示[8]。

持水力測定：參照劉亞瓊等[9]的方法，將離心條件修改為轉速8 000×g，時間10 min，溫度15 ℃。

pH：實驗室pH計測定。

固形物含量測定：利用減壓干燥法，真空干燥箱、扁形鋁制或玻璃制稱量瓶、干燥器內附有效干燥劑，天平感量為0.1 mg。

脂肪測定：按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》進行測定。

蛋白質水解：Foss 8400全自動凱氏定氮儀，準確稱取1 g樣品，進行凱氏定氮測含氮總量(total nitrogen，TN)。參考MANE等[10]、SAHINGIL等[11]和LIU等[12]的方法并略加修改，分別測定pH 4.6-可溶性氮(soluble nitrogen，SN)、12%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)-SN和5%精對苯二甲酸(pure terephthalic acid，PTA)-SN含量。

質構分析：探頭型號TA25/1 000；平端直徑50 mm；測試前探頭下降速度10.0 mm/s；測試速度1.0 mm/s；測試后探頭回程速度1.0 mm/s；時間5.00 s；測試距離15.00 mm；觸發力5 g[13]。

黏度測定、流變學特性分析：采用小振幅頻率掃描法測定發酵乳的流變特性。選用DHR-3旋轉流變儀，直徑40 mm的不銹鋼平板探頭，平板與底面的間隙為1 mm，測試溫度控制在25 ℃。

感官評價：根據GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》的要求，參考酸奶感官評分標準，結合牦牛發酵乳特有的感官特性，制定評分標準。

1.4 數據分析

重復試驗3次，試驗結果以平均值±標準差來表示，用分析軟件SPSS 19.0對實驗結果進行統計學分析，顯著性檢驗采用 ANOVA 程序中的Duncan法，P<0.05即差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同益生菌株發酵乳特性比較

2.1.1 不同益生菌對牦牛發酵乳酸度及pH值的影響

發酵過程中，不同益生菌對牦牛發酵乳發酵過程酸度有顯著影響。如圖1-a所示，隨著發酵時間延長，益生菌配合普通發酵劑YO-MIX 883(益生菌混合發酵組)使得發酵乳酸度顯著提升，變化趨勢與普通發酵劑類似，發酵終點(6 h)酸度維持在70 °T左右。然而，3株益生菌單獨發酵酸度沒有達到理想的食用酸度，僅有20～40 °T，也就是說，在實驗設定的發酵時間內，單獨益生菌不能成功發酵牦牛乳。與對照組相比，益生菌混合發酵組終點pH值略高，但是顯著低于益生菌單獨發酵組(圖1-b)。無論是單一菌種還是混合菌種，發酵階段將乳糖轉化為乳酸，酸度變化均呈現上升趨勢。

在冷藏過程中控制酸度的增加，對發酵乳的感官和品質有著重要的影響，后酸化是活菌發酵乳產品面臨的重要問題[14]。在冷藏階段，益生菌混合發酵組酸度略有上升，而3株益生菌單獨發酵上升明顯(圖1-c)。冷藏4 d后，唾液乳桿菌AR809、植物乳桿菌AR501混合發酵制備的發酵乳酸度(100、 99 °T)顯著低于對照組(109 °T)以及植物乳桿菌AR495混合發酵組(107 °T)(P<0.05)。發酵乳制備過程中，隨著蛋白質和脂肪的降解，發酵乳體系呈良好的酸堿緩沖狀態，因此，酸度變化與pH可能不太一致。冷藏過程中，益生菌混合發酵組制備的牦牛發酵乳pH略高于對照組(圖1-d)。從冷藏過程后酸化控制效果來看，AR809和AR501混合發酵效果較好。在冷藏階段，溫度的降低使酸度增長趨于緩和，潘紅梅等[15]研究表明，添加了植物乳桿菌的發酵乳在一定程度上酸度的增長變慢，植物乳桿菌和普通發酵菌相互作用，從而控制后酸化。

a-發酵過程中酸度變化;b-發酵終點pH值;c-冷藏期間酸度變化;d-冷藏期間pH值變化圖1 不同益生菌對牦牛發酵乳酸度及pH值的影響Fig.1 Effects of different probiotics on lactic acidity and pH of yak fermentation注:同一時間點不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 不同益生菌對牦牛發酵乳持水力的影響

持水力是酸奶的重要理化指標之一，直接影響酸奶的組織狀態[16]。牦牛發酵乳在冷藏前期(1～2 d)，發酵乳持水力呈上升趨勢，隨后趨于穩定(圖2)。對冷藏第4天持水力顯著性分析表明，與對照組相比，AR809混合發酵制備的牦牛發酵乳持水力最高，達到74.54%，顯著高于其余益生菌發酵組(P<0.05)，表現為發酵乳質地細膩，凝固性好，乳清析出少。人源唾液乳桿菌AR809較高的黏附性，使其在發酵乳中與普通發酵劑的相互作用下可以高效生長，保持了較高的持水力[6]。在相同冷藏條件下，AR809、AR495組的凝膠效果更強，乳蛋白膠體結合水的能力增強，菌體在冷藏期間緩慢生長，其持水力在冷藏后期有緩慢上升的趨勢。但是3株益生菌單獨發酵的牦牛發酵乳在發酵結束時未完全凝固，傾斜即發生破裂。

圖2 不同益生菌對牦牛發酵乳持水力的影響Fig.2 Effects of different probiotics on water holding capacity of yak fermented milk注：顯著性是所有的發酵組與對照組對比，***表示P<0.001

2.1.3 不同益生菌對牦牛發酵乳黏度的影響

發酵乳容易出現黏稠度低，顆粒感強，乳清析出等問題[17]。發酵過程中，蛋白凝乳增加了發酵乳的黏稠度。如圖3所示，不同益生菌對牦牛發酵乳黏度有顯著性影響(P<0.05)。冷藏1 d，益生菌混合發酵組與對照組黏度差異不大，僅AR809混合發酵組有顯著性差異。隨著冷藏時間的延長，益生菌混合發酵組的黏度顯著增加，尤其是AR809與AR495混合發酵組，而對照組黏度變化趨于穩定。冷藏4 d，AR809、AR495混合發酵組黏度分別達到3.11、2.38 Pa·s，為冷藏1 d的1.82、1.47倍。組內比較顯示，冷藏4 d后益生菌混合發酵組制備的牦牛發酵乳黏度顯著高于對照組，其中AR890混合發酵組黏度最高，為對照組的1.98倍。對于益生菌單獨發酵組，由于酸化程度較弱，牦牛乳凝乳失敗，因此發酵乳黏度始終處于較低水平。

綜上所述，唾液乳桿菌AR809在冷藏過程中能夠較好地控制后酸化程度，從而不影響發酵乳口感，并且通過增加持水力和黏度來提高發酵乳的穩定性。因此，后續實驗選用AR809作為益生菌發酵劑，配合普通發酵劑制備牦牛益生菌發酵乳，考察發酵乳蛋白降解、流變等特性。

圖3 在剪切速率為10 s-1時不同益生菌對牦牛發酵乳黏度的影響Fig.3 Effect of different probiotics on the viscosity of yak fermented milk at a shear rate of 10 s-1

2.2 唾液乳桿菌AR809在牦牛發酵乳中特性的研究

2.2.1 唾液乳桿菌AR809提高牦牛發酵乳蛋白水解程度

實驗以牦牛乳為原料，利用唾液乳桿菌AR809以及普通發酵劑制備牦牛酸奶，考察添加AR809對牦牛發酵乳品質的影響。實驗結果如表1所示，AR809在發酵及冷藏期間產生胞外多糖等代謝產物，形成品質較好凝乳的同時，牦牛發酵乳固形物含量稍有提升，但是沒有顯著性，達到23.81%。冷藏結束后AR809混合發酵組與普通發酵劑組的總氮和總脂肪含量沒有顯著性差異。但是蛋白降解分析表明，與對照組相比，AR809混合發酵組12%TCA-SN和5%PTA-SN指標有顯著提高，分別提高了78.22%、40.78%，而pH 4.6-SN無顯著變化。pH 4.6-SN代表的是蛋白水解廣度[10]，表征的是中肽和小肽的含量，12%TCA-SN代表蛋白質水解深度[11]。磷鎢酸溶液是一種辨別力很強的蛋白質沉淀劑，在5%PTA磷鎢酸溶液中，所有蛋白質都會沉淀，只有游離氨基酸(賴氨酸和精氨酸除外)和一些短鏈縮氨酸能溶解在其中。因此通常用5%PTA-SN來表征游離氨基酸含量[12]。結果表明，添加唾液乳桿菌AR809進行牦牛發酵乳制備，能有效加強發酵乳蛋白降解，提高發酵乳中肽及游離氨基酸水平。

表1 不同牦牛發酵乳樣品理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of different yak fermented milk samples

2.2.2 唾液乳桿菌AR809改善牦牛發酵乳質構特性

對牦牛發酵乳的質構特性進行對比分析，包括第一循環硬度、黏附性、第二循環硬度、內聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性、凝膠強度、黏附力等方面，實驗結果如表2所示。唾液乳桿菌AR809混合發酵組能夠顯著改善牦牛發酵乳質構特性。在所測定指標中第一循環硬度、黏附性、第二循環硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性有顯著提升，其中，咀嚼性、黏附性以及彈性提升最為明顯，達到20.42 mJ、21.34 N·mm、14.39 mm，分別為對照組的2.88、2.75、1.68倍。2組酸奶的內聚性、凝膠強度以及黏附力指標沒有顯著變化。AR809菌株產生的胞外多糖等代謝產物，使得發酵乳具有較好的拉絲性和黏稠性，對質構特性有顯著影響，表現為較高的表觀黏度和硬度。這與蔣萌蒙等[18]的研究結果是相同的，劉文文等[13]的實驗中第一循環硬度、彈性也是顯著提高的，與本實驗的結論一致。

表2 不同牦牛發酵乳樣品質構特性Table 2 Texture characteristics of different yak fermented milk samples

2.2.3 流變學特性分析

采用流變儀分析不同發酵乳樣品的流變特性，結果如圖4-a所示。添加唾液乳桿菌AR809對牦牛發酵乳剪切流變行為無顯著影響，對照組和AR809混合發酵組的表觀黏度都隨剪切速率的增加而降低，表現出剪切稀化的流體行為，屬于假塑性流體。然而，添加AR809能夠改變黏度曲線的形狀，無論是在低剪切速率還是高剪切速率下，AR809混合發酵組都顯示出比對照組樣品明顯更高的表觀黏度。這可能是AR809的加入有利于酪蛋白的凝乳，從而增加發酵乳黏度[19]。

對不同樣品的黏彈性進行分析，結果表明，對照組和AR809混合發酵組的儲能模量(G′)顯著大于損耗模量(G″)[20]，表現出弱的黏彈性凝膠特性，并且G′和G″均對頻率有輕微的依賴性(斜率相同)(圖4-b)。隨著AR809的加入，G′和G″均呈現上升趨勢，儲能模量的增大，AR809的加入有利于酪蛋白的凝乳結構。損耗角正切(tanδ)考慮到了儲能模量和損耗模量的貢獻(tanδ=G″/G′)，它可以提供有關材料黏彈性的更多信息。tanδ較低(阻尼系數)是指材料彈性成分的更強貢獻，可有助于增加結構的異質性，從而減少與其他基質(例如唾液)的溶混性[21]。tanδ較低的樣品比阻尼系數較高的樣品更粗大；雖然所有樣品的G′曲線顯示出相似的頻率依賴性(相似的斜率)，但tanδ曲線在樣品中仍能表現出差異。包含AR809的發酵乳表現出明顯更高的儲能模量和較高的tanδ值，這表明其凝膠結構比對照的凝膠結構更多，使得牦牛發酵乳有厚重口感的同時兼有些許順滑[22](圖4-c)。流變學特性分析與前面質構變化研究具有一致性。

2.2.4 感官評價

建立感官評價小組[8],篩選實驗室人員培訓，由10名品評員組成酸奶感官評價小組。參考TAKUNRAT等[23]并根據牦牛發酵乳特點建立感官描述詞(表3)。由感官評價小組對2組發酵乳樣品進行感官分析，最終的感官評分如圖5所示。結果顯示，添加唾液乳桿菌AR809能夠顯著提高牦牛發酵乳適口性、組織狀態、黏附性以及酸甜比，表現為AR809混合發酵組凝固均勻，表面無氣泡、龜裂現象，質地評分較高；而對照組發酵組有少量乳清析出，適口性較差。其余指標如顆粒感、奶香味以及糊口感無顯著差異。

a-牦牛發酵乳表觀黏度曲線；b-儲存模量彈性模量掃描曲線；c-損耗角正切掃描曲線圖4 牦牛發酵乳流變學特性Fig.4 Rheological properties of yak fermented milk

表3 感官評價評分標準Table 3 Sensory evaluation scoring standard

圖5 原味和益生菌牦牛發酵乳感官評價雷達圖Fig.5 Radar chart of sensory evaluation of raw and probiotic yak fermented milk

3 結論

前期研究表明，唾液乳桿菌AR809能夠有效緩解細菌性咽炎，并且具有良好的胞外多糖合成能力。本文研究表明AR809能夠應用于牦牛發酵乳制備，顯著改善牦牛發酵乳品質。添加唾液乳桿菌AR809，能夠有效控制牦牛發酵乳冷藏過程的后酸化，并且提高發酵乳黏度以及持水力，加強牦牛乳蛋白的水解。質構和流變分析表明，AR809能夠提高牦牛發酵乳彈性和咀嚼性，提高發酵乳表觀黏度，使得凝乳細膩均勻。感官分析進一步表明，AR809能夠提高牦牛發酵乳的適口性和組織狀態。本文研究結果表明，添加唾液乳桿菌AR809能夠有效改善牦牛發酵乳品質，并且為牦牛發酵乳帶來更好的生理活性。