木姜葉柯全發酵茶的活性成分及其降血糖活性研究

劉韞滔，黃偉民，李誠，劉愛平，王體強，唐婷婷

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)2(蘆山縣樹蟲草茶農專業合作社，四川 雅安，625600)

木姜葉柯(Lithocarpuslitseifolius(Hance)Chun)，別名甜茶，在我國民間已有上千年的食用歷史，是一種藥食兩用、兼具茶、糖、藥3種功能的植物，其中以四川、湖南和云南資源最為豐富[1]。民間常采集木姜葉柯的嫩葉食用，據稱有生津止渴、消除疲勞之功效[2]，其生物資源量巨大，僅我國木姜葉柯年產量可達數萬噸。《中華中藥志》《全國中草藥匯編》和《本草綱目》都對木姜葉柯的藥理作用和實踐應用有相關記載，鑒于木姜葉柯的藥理作用以及民間千百年實踐應用已證實其安全、無毒副作用，木姜葉柯已被批準為新食品原料[3]。由于木姜葉柯葉片中含有些許澀味，影響其口感，所以雅安當地居民習慣將其制備成全發酵木姜葉柯茶，以降低其澀味，同時保留甘甜的特色。

研究發現木姜葉柯的主要活性成分為黃酮類化合物，主要分布于葉部位，目前已從其葉中分離鑒定至少22種黃酮類成分[4]。三葉苷、根皮苷和3-羥基根皮苷等二氫查爾酮類化合物為其主要黃酮類成分，其甜度為蔗糖的300倍[5]，而熱量極低，是非常理想的天然低熱量功能性甜味劑，并且根皮苷在糖尿病及其并發癥的防治中具有獨特的效果[6]。除此之外，木姜葉柯中三葉苷和根皮苷還被廣泛的證明具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、預防/治療血管疾病等生物活性[7-10]。然而，目前多為對木姜葉柯干燥葉或鮮葉生物學活性的研究，未見對其全發酵茶的降血糖活性研究。因此，本研究通過傳統的全發酵茶加工工藝制備木姜葉柯全發酵茶，并對其總多酚、總黃酮、三葉苷、根皮苷以及兒茶素類化合物的含量進行測定，以全面評價全發酵茶加工工藝對木姜葉柯潛在活性成分的影響。同時，本研究探究木姜葉柯和木姜葉柯全發酵茶的乙醇提取物對鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病小鼠的降血糖、降血脂和抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木姜葉柯(2019年11月采摘)，由蘆山縣樹蟲草茶農民專業合作社提供；沒食子酸標準品(含量>98%)、蘆丁標準品(含量>98%)、甲醇(HPLC級)、冰乙酸(HPLC級)，成都浩搏優科技有限公司；三葉苷標準品(含量>98%)、根皮苷標準品(含量>98%)、兒茶素(catechins，C)標準品(含量>98%)、表兒茶素(epicatechin，EC)標準品(含量>98%)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)標準品(含量>98%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)標準品(含量>98%)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)標準品(含量>98%)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)標準品(含量>98%)，成都德思特生物技術公司；格列本脲和STZ，Sigma-Aldrich公司；SXT血糖儀和血糖試紙，三諾生物有限公司；胰島素、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein chesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純；實驗所用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀(包括1260DAD型檢測器)、Varioskan LUX酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；AB1104-N電子分析天平，Mettler Toledo公司；DSA100-GL1超聲波清洗機，福州德森精工有限公司；TDZ4-WS臺式低速離心機，湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗動物

雄性ICR小鼠(18±2) g,成都達碩動物有限公司，飼養于恒溫恒濕條件下[溫度(22±2) ℃，相對空氣濕度(55±5)%]的房間(12 h照明，12 h黑暗)，所有小鼠均可自由飲食和飲用水。待小鼠完全適應飲食和環境后，一周后開始實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 木姜葉柯全發酵茶加工工藝

加工工藝流程如下：

木姜葉柯鮮葉→萎凋→殺青→揉捻→發酵→干燥→木姜葉柯全發酵茶

具體操作步驟如下：

(1)采用自然萎調的方法進行攤涼，木姜葉柯鮮葉均勻散放在通風網架上，厚度3～5 cm，攤晾24 h；

(2)用燃燒加熱式小型滾筒殺青機將攤晾葉殺青，鍋溫380～400 ℃，殺青6～8 min；

(3)采用茶葉揉捻機進行揉捻，揉捻30 min；

(4)揉捻后的木姜葉柯葉放入恒溫恒濕培養箱中發酵，溫度25～30 ℃，相對空氣濕度85%以上，時間24 h；

(5)將發酵葉放入鼓風干燥箱，100 ℃烘至足干。

1.4.2 木姜葉柯活性成分的測定

總多酚含量的測定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，采用Folin-Ciocalteu比色法測定樣品總多酚含量[11]。總黃酮含量的測定參照SN/T 4592—2016《進出口食品中黃酮的測定》，采用Al3+比色法測定樣品總黃酮含量[12]。

三葉苷和根皮苷含量的測定是參照CHEN等[13]所述方法，并進行修改。準確稱取0.25 g樣品，加入適量70 ℃的70%乙醇溶液，用玻璃棒充分攪拌至均勻濕潤，60 ℃超聲處理(100 W，40 kHz)30 min，經冷卻后，放入離心機中，在3 500 r/min下離心10 min，取上清液0.5 mL至50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容，過0.45 μm的濾膜，提取液用于高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。色譜柱：Target C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：100%甲醇(A)∶0.2%冰乙酸(B)=48∶52；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：285 nm。

兒茶素含量的測定參照GB/T 8313—2018[11]所述方法，并進行修改。準確稱取0.20 g樣品，加入經過70 ℃的70%甲醇溶液10 mL，用玻璃棒充分攪拌至均勻濕潤，立即移入70 ℃水浴中，浸提20 min(隔10 min攪拌一次)，冷卻后，放入離心機中，在3 500 r/min下離心10 min，將上清液過濾至25 mL容量瓶中，殘渣再用10 mL 70%甲醇水溶液提取一次，重復以上操作，合并提取液，用甲醇溶液定容至25 mL，過0.45 μm的濾膜，提取液用于HPLC分析。色譜柱：Target C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：100%甲醇(A)∶0.2%冰乙酸(B)；流速：0.9 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：278 nm。

表1 兒茶素各組分測定梯度洗脫表Table 1 Linear gradient elution of catechin components

1.4.3 木姜葉柯提取物的制備

木姜葉柯提取物(Lithocarpuslitseifoliusextracts，LLEs)的制備參照LIANG等[14]所述方法。將木姜葉柯(1 kg)粉碎過60目篩，并用5 L 70%乙醇回流提取2次，每次2 h。提取液過濾后，用旋轉蒸發儀濃縮，并在真空干燥器中于105 ℃干燥成粉末，得LLEs。木姜葉柯全發酵茶提取物(Lithocarpuslitseifoliuswhole fermentation tea extracts，LLFEs)的制備與此方法一致。

1.4.4 動物模型的建造、分組與給藥

隨機選取造模備選小鼠，禁食12 h后稱重。將STZ溶于緩沖液(0.1 mol/L檸檬酸鈉和0.1 mol/L檸檬酸，pH 4.2～4.5)，并迅速腹腔注射(注射劑量為100 mg/kg)[15]。72 h后，對多飲、多尿的小鼠進行空腹血糖測試，血糖水平大于16.8 mmol/L的則為模型成功。

將造模成功的小鼠被隨機分配到以下實驗組里(每組6只小鼠)：

(1)組Ⅰ(對照)：正常小鼠；

(3)組Ⅲ(陰性對照)：經STZ誘導的糖尿病小鼠(灌胃蒸餾水)；

(4)組Ⅳ：經STZ誘導的糖尿病小鼠口服LLEs[灌胃量200 mg/(kg·d)]；

(5)組Ⅴ：經STZ誘導的糖尿病小鼠口服LLFEs[灌胃量200 mg/(kg·d)]。

1.4.5 小鼠待測組織的采集與制備

經30 d飼養，所有供試的小鼠禁食12 h。測定小鼠的體重和血糖，并對小鼠眼球取血，將收集的血液迅速離心(5 000 r/min、5 min、4 ℃)獲得血清，保藏于-80 ℃冰箱；采用頸椎脫位法處死所有供試小鼠，并切取小鼠的胰腺、部分腎臟和肝臟用于組織病理學分析(蘇木精-伊紅染色)，其余腎臟和肝臟保藏于-80 ℃冰箱，待測試。

1.4.6 小鼠生理指標測試

小鼠尾部取血后，用血糖儀測定小鼠血糖水平；血清中胰島素、TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量遵照相應試劑盒的說明書進行測定；小鼠胰腺、腎臟和肝臟組織分別加入冰冷的5 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(包含2 mmol/L 乙二胺四乙酸，pH 7.4)緩沖液于勻漿器中勻漿(置于冰上)，均質后離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，上層液體用于GPx、SOD、CAT活性和MDA水平的測定(具體操作參照相應試劑盒的說明書)。

（2）定期開展安全培訓和安全教育。特別針對管理人員以及重點的操作工作人員進行全面的安全教育和專業技能培訓，全面提高自身綜合水平和安全意識。對于安全培訓與教育制度對工作人員的具體內容、培訓時間以及方法和形式、要達到的效果要進行明確進行的要求并進行嚴格考察。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析。實驗數據采用平均值±標準差(SD)表示，采用t檢驗進行數據統計分析，以P<0.05表示有顯著統計學意義。

2 結果與分析

2.1 全發酵茶加工對木姜葉柯主要活性成分含量的影響

表2為全發酵茶加工對木姜葉柯主要活性成分含量的影響。由表2可知，木姜葉柯全發酵茶總多酚和總黃酮的含量均降低，其中總多酚的含量由12.71%下降到9.36%，下降26.39%；總黃酮的含量1.46%下降到1.12%，下降23.29%。三葉苷和根皮苷是木姜葉柯中的主要甜味成分[16]，由表2可知，木姜葉柯經萎調、殺青、揉捻、發酵和干燥等工藝后，木姜葉柯全發酵茶中三葉苷和根皮苷的含量均降低，其中三葉苷由276.38 mg/g下降至248.09 mg/g，下降10.24%；根皮苷由39.09 mg/g下降至23.70 mg/g，下降39.37%。李勝華等[17]通過比較不同加工過程木姜葉柯中二氫查耳酮的含量發現，木姜葉柯在加工成茶葉的過程中二氫查爾酮的含量基本不變，仍然可維持較高的甜味，與本研究的結果基本一致。這可能是由于二氫查耳酮類化合物不易受多酚氧化酶的作用，且二氫黃酮類與查耳酮類成分發生較明顯異構化反應所需的溫度較高，因此加工過程中二氫查耳酮含量基本不變[18]。

表2 全發酵茶加工對木姜葉柯活性成分含量的影響Table 2 Effect of Lithocarpus litseifolius on content of active components in traditional process

兒茶素類化合物是木姜葉柯中主要澀味物質，由表2可知，木姜葉柯全發酵茶中6種兒茶素含量均降低，其中C、EC和GCG的含量大幅下降，分別下降70.67%、79.73%和74.58%。這是由于兒茶素類化合物在加工過程中多酚氧化酶的作用下參與眾多反應，兒茶素B環中含有酚羥基，極易被氧化為鄰醌，再通過苯駢環化反應生成茶黃素類物質，且兒茶素類化合物是參與構成全發酵茶中茶黃素的前體物質，從而提升茶湯品質，因此在加工過程中含量大幅下降[19]。

2.2 木姜葉柯提取物對STZ糖尿病小鼠的影響

2.2.1 對STZ糖尿病小鼠的體重及其血糖、胰島素水平的影響

在本研究中，STZ對小鼠有明顯的糖尿病誘導作用，小鼠表現為多飲、多食和多尿的糖尿病癥狀[20]。由表3可知，與正常小鼠相比，經STZ誘導的糖尿病小鼠出現體重下降，其中糖尿病小鼠(組Ⅲ)的體重相對于正常小鼠(組Ⅰ)顯著降低(P<0.05)，而空腹血糖水平卻顯著升高(P<0.05)，這可能是由于結構蛋白的丟失或降解所致[21]。在分別服用LLEs、LLFEs(組Ⅳ和組Ⅴ)和格列本脲(組Ⅱ)治療30 d后，糖尿病小鼠的血糖恢復至正常水平(<16.8 mmol/L)，顯著低于沒有服用任何藥物的糖尿病小鼠(P<0.05)，但略高于正常小鼠(組Ⅰ)，組Ⅴ小鼠的血糖水平較組Ⅳ小鼠更低(P<0.05)。同時，測定小鼠體重發現，與陰性對照組(組Ⅲ)相比，組Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ小鼠的體重并沒有顯著提高(P>0.05)。結果表明LLEs和LLFEs均能夠降低經STZ誘導糖尿病小鼠的血糖水平，具有較好的降糖作用，但并不能改善糖尿病小鼠體重減輕的情況。

由表3可知，STZ誘導的糖尿病小鼠胰島素水平下降。與陰性對照組(組Ⅲ)小鼠相比，格列本脲治療糖尿病小鼠的的胰島素水平顯著升高，這主要是由于格列本脲增加胰島β細胞內鈣的水平[22]。此外，經LLEs和LLFEs處理的糖尿病小鼠的胰島素水平顯著高于組Ⅲ，但低于組Ⅰ和組Ⅱ。表明LEs能夠調節其降血糖的可能作用機制是通過增加胰島素分泌，這與ZHOU等[23]的研究結果一致。最新研究表明，食用植物類黃酮可通過保護和增加胰島β細胞的增殖，并通過激活cAMP/PKA信號通路增加胰島素分泌，從而預防或治療糖尿病[24]。

2.2.2 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠抗氧化酶活性的影響

研究表明氧化應激在糖尿病及其并發癥中起重要作用，可導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生、降低抗氧化防御系統的響應水平，并且會導致機體(特別是腎臟和肝臟)的氧化損傷[25]。機體內的抗氧化酶(GPx、SOD和CAT)被認為是抗氧化應激的第一道防線，能夠清除自由基并保護細胞免受ROS的損傷。此外，MDA是脂質過氧化的最終產物，可作為細胞損傷的指標。體內MDA的水平越高，說明氧化損傷越嚴重，且能夠使抗氧化酶活性降低。

表3 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠的體重及其血糖、胰島素水平的影響Table 3 Effect of LLEs on body weight, blood glucose and insulin level in STZ-induced diabetic mice

本研究測定腎臟和肝臟中GPx、SOD和CAT的活性和MDA的水平。如圖1所示，與正常小鼠(組Ⅰ)相比，STZ誘導的糖尿病小鼠(組Ⅲ)腎臟和肝臟中GPx、SOD和CAT的活性顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)。有研究表明STZ可產生ROS，表明抗氧化藥物可能有利于治療糖尿病引起的機體氧化損傷[26]。在服用格列本脲治療30 d后，組Ⅱ中糖尿病小鼠腎臟和肝臟中GPx、SOD和CAT的活性均無顯著差異，MDA的水平無顯著差異(P>0.05)。結果表明，格列本脲對腎臟和肝臟的抗氧化酶活性沒有調節作用，這與之前的研究[27]所觀察到的結果一致。此外，與組Ⅱ和Ⅲ相比，經LLEs和LLFEs(組Ⅳ和Ⅴ)治療30 d后，糖尿病小鼠腎臟和肝臟中GPx、SOD和CAT的活性顯著提高(P<0.05)，MDA的水平顯著降低(P<0.05)。腎臟和肝臟中MDA的水平降低可能是由于抗氧化酶活性的增強，這與單思聰等[28]的研究結果一致。

值得注意的是，組Ⅴ腎臟中SOD的活性、MDA水平和肝臟中GPx、SOD的活性與正常小鼠無顯著差異(P>0.05)，表明經LLFEs治療，糖尿病小鼠的抗氧化指標基本恢復正常。這些結果也表明，LLEs和LLFEs均可清除活性氧自由基，并且提高這些抗氧化酶的活性。同時，與組Ⅳ相比，組Ⅴ除腎臟中CAT的活性無顯著差異(P>0.05)外，其余抗氧化酶的活性均顯著上升(P<0.05)，且糖尿病小鼠腎臟和肝臟中MDA的水平顯著降低(P<0.05)。這可能是全發酵茶加工過程中，酚類物質在多酚氧化酶的作用下發生復雜的化學反應，從而增加全發酵茶中酚類化合物的種類，導致LLFEs清除自由基的能力增加[29]。

A-GPx活性;B-SOD活性;C-CAT活性;D-MDA水平圖1 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠的抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effect of LLEs on activities of antioxidant enzymes in kidney and liver of STZ-induced diabetic mice

2.2.3 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠血清中脂質水平的影響

糖尿病是一種常見代謝慢性疾病，脂質代謝異常是糖尿病常見的代謝紊癥狀，可導致血脂異常、多種器官功能損害、心血管疾病等一系列并發癥。脂質代謝異常具體表現在TC、TG和LDL-C的含量升高，HDL-C的含量降低[30]。有研究表明，HDL-C在膽固醇從外周轉運至肝臟的過程中發揮重要作用，對血脂有積極的調控作用，可降低心血管疾病的風險[31]。因此，研究了正常小鼠和STZ誘導的糖尿病小鼠血清中脂質水平(TC、TG、LDL-C和HDL-C)的變化。

由圖2可知，與正常小鼠(組Ⅰ)相比，STZ誘導的糖尿病小鼠(組Ⅲ)TC、TG和LDL-C的含量顯著升高(P<0.05)，HDL-C的含量顯著降低(P<0.05)。在給藥治療30 d后，與未給藥糖尿病小鼠相比，組Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ中糖尿病小鼠TC、TG和LDL-C的含量顯著降低(P<0.05)，HDL-C的含量均顯著升高(P<0.05)。表明格列本脲和LEs可通過調節糖尿病小鼠血脂異常而降低心血管疾病的發生。此外，與組Ⅳ相比，組Ⅴ中糖尿病小鼠TG和LDL-C的含量顯著降低(P<0.05)，HDL-C的含量顯著升高(P<0.05)，且與正常小鼠無顯著差異(P>0.05)。表明LLFEs對STZ誘導糖尿病小鼠的降血脂作用比LLEs更明顯。

圖2 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠血清中脂質水平的影響Fig.2 Effect of LLEs on lipids levels in STZ-induced diabetic mice

2.3 病理組織學分析

2.3.1 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠胰腺組織的病理學影響

如圖3-C所示，經STZ誘導的糖尿病小鼠(組Ⅲ)胰腺組織病理學變化表現為胰腺泡萎縮，胰島細胞數量減少，部分胰島細胞凋亡并被大量溶解的紅細胞代替，其間毛細血管擴張充血，胰島及間質血管周圍有少量炎細胞浸潤。服用LLEs和LLFEs治療 30 d 后，與組Ⅲ(圖3-C)相比，糖尿病小鼠胰腺組織部分恢復正常，胰腺泡萎縮減弱，毛細血管擴張充血減弱，且炎細胞浸潤消失(圖3-D和3-E)。表明LLEs和LLFEs均對糖尿病小鼠的胰腺組織有明顯的修復作用和保護功效。與組Ⅳ相比，組Ⅴ糖尿病小鼠(圖3-E)胰腺泡減弱和胰腺間質淤血消失更明顯，表明LLFEs對糖尿病小鼠胰腺組織的修復作用更顯著。由圖3-B可知，服用格列本脲的糖尿病小鼠(組Ⅱ)的胰腺組織損傷并未得到修復，且出現大量組織壞死、胰島細胞溶解被紅細胞代替，表明格列本脲對糖尿病小鼠的胰腺沒有修復作用。

A-組Ⅰ(對照);B-組Ⅱ(陽性對照);C-組Ⅲ(陰性對照);D-組Ⅳ(糖尿病+LLEs);E-組Ⅴ(糖尿病+LLFEs)圖3 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠胰腺組織的病理學影響(×100)Fig.3 Effects of LLEs treatment on pancreas damage in STZ-induced diabetic mice注：病理學影響采用蘇木精-伊紅染色處理(下同)

2.3.2 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠腎臟組織的病理學影響

如圖4-C所示，經STZ誘導的糖尿病小鼠(組Ⅲ)腎臟組織病理學變化表現為腎小球結構不清晰，有部分纖維化現象，少部分腎小管結構被破壞且伴有部分腎小管上皮細胞空泡變性，間質內有少量淤血和蛋白沉淀物。服用LLEs和LLFEs治療30 d后，與組Ⅲ相比，糖尿病小鼠腎臟組織結構基本恢復正常，腎小球結構清晰且無纖維化跡象，腎小管上皮細胞空泡變性減弱，間質內只有少量淤血和蛋白沉淀物(圖4-D和4-E)。表明LLEs和LLFEs均對糖尿病小鼠的腎臟組織有明顯的修復和保護功效。同時，組Ⅳ和組Ⅴ的腎臟組織之間也沒有顯著性的病理差別，表明經全發酵茶加工后木姜葉柯提取物對小鼠腎臟的保護作用沒有明顯提升。由圖4-B可知，服用格列本脲的糖尿病小鼠(組Ⅱ)的腎臟組織損傷不僅沒有修復，且大部分腎小球結構被破壞，細胞空泡變性加重和間質出現大量淤血和蛋白沉淀物，表明格列本脲對糖尿病小鼠的腎臟沒有修復作用。

A-組Ⅰ(對照);B-組Ⅱ(陽性對照);C-組Ⅲ(陰性對照);D-組Ⅳ(糖尿病+LLEs);E-組Ⅴ(糖尿病+LLFEs)圖4 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠腎臟組織的病理學影響(×100)Fig.4 Effects of LLEs treatment on kidney damage in STZ-induced diabetic mice

2.3.3 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠肝臟組織的病理學影響

如圖5-C所示，經STZ誘導的糖尿病小鼠(組Ⅲ)肝臟組織病理學變化表現為肝細胞索狀結構部分消失，細胞排列紊亂，細胞核變形，部分肝細胞存在脂肪性變性，肝中央靜脈擴張并且周圍存在大量炎癥細胞侵潤。服用LLEs和LLFEs治療30 d后，與組Ⅲ(圖5-C)相比，糖尿病小鼠肝細胞組織結構基本恢復正常，肝細胞索狀結構清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，中央靜脈擴張減弱且炎癥消失(圖5-D和5-E)。表明LLEs和LLFEs均對糖尿病小鼠的肝臟組織有明顯的修復作用和保護功效。值得注意的是，與組Ⅳ相比，組Ⅴ糖尿病小鼠的肝臟組織中央靜脈擴展減弱更明顯，表明LLFEs對小鼠肝組織的保護作用更明顯。由圖5-B可知，服用格列本脲的糖尿病小鼠(組Ⅱ)的肝臟組織損傷不但未得到修復，且肝臟細胞排列紊亂加劇，索狀結構完全消失，出現纖維組織增生，表明格列本脲對糖尿病小鼠的肝臟沒有修復作用。

A-組Ⅰ(對照);B-組Ⅱ(陽性對照);C-組Ⅲ(陰性對照);D-組Ⅳ(糖尿病+LLEs);E-組Ⅴ(糖尿病+LLFEs)圖5 木姜葉柯提取物對糖尿病小鼠肝臟組織的病理學影響(×100)Fig.5 Effects of LLEs treatment on liver damage in STZ-induced diabetic mice

3 結論

本研究通過制備木姜葉柯全發酵茶并測定其主要活性成分，其中，總多酚和總黃酮的含量分別降低26.36%和23.29%，主要甜味物質三葉苷和根皮苷的含量分別降低10.24%和39.37%，主要澀味物質兒茶素類化合物的含量降低61.38%。表明制備木姜葉柯全發酵茶可有效降低木姜葉柯的澀味，并保留其甜味物質。同時，采用乙醇回流提取法提取木姜葉柯及其全發酵茶的二氫查耳酮，主要為三葉苷和根皮苷，并對其降血糖活性進行研究。發現木姜葉柯提取物對STZ誘導的糖尿病小鼠均表現出降血糖、降血脂、改善抗氧化狀態、減輕胰腺、腎臟和肝臟損傷的作用，且木姜葉柯全發酵茶提取物表現出更好的效果。本研究結果可為木姜葉柯在發酵茶飲的加工以及木姜葉柯多酚和黃酮在天然功能性食品中的應用提供理論依據和技術參考。